합성생물학 및 시스템생물학 기반 클로스트리듐 대사공학
Date 2018-04-15 16:19:09 페이스북으로 보내기 트위터로 보내기 hit 599
장유신
교수
경상대학교 응용생명과학부
jangys@gnu.ac.kr

1. 서론


그람 양성균인 Clostridium 은 절대 혐기성 조건에서 자라는 포자를 형성하는 대표적인 미생물이다[1]. 특히, Clostridium acetobutylicum, Clostridium beijerinckii, Clostridium pasteurianum 등은 두 개의 상을 가진 대사회로(biphasic pathway)를 가지고 있는 대표적 미생물이며, 산 생성기일 때는 아세트산과 부티르산을 생성하고, 용매 생성기일 때는 부탄올, 에탄올, 아세톤을 생성한다[2, 3]. 이 화합물들은 산업용 유기용매로써 사용되거나 다른 화합물 합성의 전구체로 사용될 수 있어 큰 관심을 받고 있다. 한편, Clostridium ljungdahlii 등과 같은 아세토젠은 일산화탄소 및 이산화탄소(C1가스, 합성가스)를 이용하여 에너지 대사를 할 수 있는 특징을 가지고 있어 바이오 화합물 생산을 위한 플랫폼으로써 최근 많은 주목을 끌고 있다[4]. 이와 같은 Clostridium 속 미생물의 광범위한 바이오매스 이용성 및 다양한 화합물 생산 능력은 기후변화 및 화석연료 고갈을 대비한 바이오 화학 및 바이오 에너지 분야에서 매우 중요하게 고려되고 있다(그림 1).

 

ff8988ddf615549fba1545a59204a354_1523776466_0323.jpg

 

그림 1. 다양한 바이오매스로부터 화합물 생산이 가능한 클로스트리듐 속 미생물의 대사회로 [3]


100여년 전부터 Clostridium 속 미생물은 아세톤과 부탄올 생산을 위한 발효산업에 활발히 사용된 바 있다. 하지만, 자연계에 존재하는 야생형 Clostridium 속 미생물을 이용한 화합물 생산은 경제성이 낮은 편이었다. 이를 극복하기 위하여 Clostridium 속 미생물의 대사흐름을 조절하여 효율적으로 화합물을 생산하고자 많은 연구가 수행되었다[5]. 초기 연구에서는 대사공학용 도구의 미비와 biphasic 특징을 가진 복잡한 대사회로 때문에 목적 화합물을 효율적으로 생산하는 균주를 개발하기 매우 어렵고 까다로웠던 것으로 잘 알려져 있었다. 비로소 최근 10 여년 동안, Clostridium 속 미생물의 대사공학은 큰 발전과 변화를 이루었으며, 이는 Clostridium 속 미생물 게놈 정보, 이를 활용한 in silico 모델, 게놈 편집도구 등과 같은 합성생물학 및 시스템생물학 분야의 발전과 깊은 연관이 있다[3]. 본고에서는 Clostridium 속 미생물 대사공학에 활용되고 있는 합성생물학 및 시스템생물학 기법들을 살펴보고, 대사공학의 대표적 예로써 부탄올, 에탄올, 이소부탄올, 2,3-butanediol 생산용 균주 개발 전략을 살펴보고자 한다.

 

2. 본론


2.1 합성생물학 및 시스템생물학 기반 Clostridium 대사공학 도구의 발전


1984년 Clostridium 속 미생물의 대사흐름분석(metabolic flux analysis) 기법 개발을 시작으로 셔틀벡터, 대사흐름조절 기술, 게놈 편집 기술 등 대사공학 도구들은 최근까지도 활발히 개발되어 보고되고 있다(그림 2) [5].

 

ff8988ddf615549fba1545a59204a354_1523776517_758.jpg 

 

그림 2. 클로스트리듐 대사공학 기술의 발전 [5]

 

또한, 최근10여년 동안 10개 이상의 Clostridium 게놈 서열이 새롭게 공개되었고, 이를 활용한 게놈 수준 대사네트워크 모델 또한 빠른 속도로 개발되고 있다(그림 3) [3].

 

ff8988ddf615549fba1545a59204a354_1523776547_8584.jpg 

그림 3. 클로스트리듐 게놈 분석 및 게놈-수준 대사네트워크 모델 개발 [3]

 

실제, 이러한 대사네트워크 모델들은 부탄올 생산성 향상을 위한 균주 개발에 유용하게 사용되기도 하였으며, C. acetobutylicum thiolase의 기능을 밝히는 연구에도 활용되었다[6, 7].
Clostridium 속 미생물의 대사흐름 조절을 위한 게놈 편집에는 ‘mobile group II intron’과 ‘CRISPR/Cas’에 근간을 둔 기법들이 개발되어 이용되고 있다. Mobile group II intron은 이동성을 가진 인트론을 게놈 상의 목적 유전자에 삽입할 수 있는 기술로 일명 ‘TargeTron’으로 불린다(그림 4).

 

ff8988ddf615549fba1545a59204a354_1523776645_0522.jpg 

 

그림 4. Mobile group II intron 기반 게놈 편집 기법 [26]

 

중온균 Clostridium 의 게놈 편집용으로는 Lactococcus lactis 유래 Ll.LtrB 인트론이 사용되고, 고온균용으로는 Thermosynechococcus elongates 에서 유래한 TeI3c/4c 인트론이 이용된다[6, 8]. 이 인트론들은 인트론 RNA 도메인과 ORF 도메인으로 구성되어있고, ORF 도메인에는 역전사효소, maturase, 엔도뉴클레아제를 암호화하는 유전자가 포함되어 있다[9, 10]. 인트론 RNA와 역전사 효소가 RNA-단백질 복합체를 형성한 후 목적 유전자에 intron RNA를 역전사하는 것으로 알려져 있다[10]. 2007년, mobile group II intron을 이용한 유전자 결실기법이 Clostridium 에 성공적으로 적용되었고(그림 2),이후 일부 그룹에서는 이를 ‘ClosTron’으로 명명하고 있다[11, 12].

CRISPR/Cas 시스템을 이용한 Clostridium 게놈 편집은 최근 3년 전부터 그 시연이 보고되고 있다. 이 기술은 세균 면역계에서 발견된 clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR) 시스템을 기반으로, 목적 DNA에 상보적인 guide RNA(gRNA)를 설계하여 crRNA 및 tracrRNA 대신 넣게 되면 목적 유전자의 이중가닥을 Cas9이 자르게 되어 게놈 편집 도구로 활용 가능한 기술이다(그림 5) [13]. 상당수 Clostridium 속 미생물에 CRISPR/Cas 시스템이 내재되어 있음이 밝혀지고 있고, 내재된 시스템을 이용한 게놈 편집이 성공한 바 있어서 향후 이를 활용한 대사공학이 활성화될 것으로 보인다(그림 5)[14].

 

ff8988ddf615549fba1545a59204a354_1523776692_1818.jpg

그림 5. CRISPR/Cas9 기반 게놈 편집 기법 [26]


2.2 부탄올 생산 대사회로 최적화


부탄올은 산업용 유기용매로써 대량 수요가 있는 한편, 연로로서 특징이 가솔린과 거의 유사하기 때문에 차세대 수송용 연료로도 입지를 확고히 하고 있다. 현재 대부분 부탄올은 석유화학 공정으로부터 만들어지고 있으나, 생물공정을 통한 생산 또한 점차 증대되고 있는 추세이다. 부탄올 생산을 위한 가장 대표적인 균주는 C. acetobutylicum 과 C.beijerinckii 라 할 수 있으며, 대사공학 연구 또한 이들 중심으로 가장 활발히 진행되었다(그림 2). 최근에는 부티르산생산 균주인 Clostridium tyrobutyricum 을 이용하거나 아세토젠인 C. ljungdahlii를 이용한 대사공학 예도 알려져 있어 같이 살펴보려 한다.
부탄올 생산 향상을 위한 C. acetobutylicum의 대사공학 전략은 유기산 대사회로를 거쳐 부탄올을 생산하는 경로를 최소화하고 곧장 부탄올을 생산하는 경로를 강화시킨 것이 가장 대표적이라 할 수 있다. 두 개의 부탄올 생합성 경로는 대사흐름분석을 기반으로 한 물질수지분석(mass balance analysis) 기법으로 분리하여 정량화한 것으로 보고하고 있다[6]. 해당 연구에서는 phosphotransacetylase와 butyrate kinase를 암호화하는 pta 및 buk 유전자를 결실하고, 효소공학을 통하여 NADH 및 NADPH를 조효소로 모두 사용할 수 있는 돌연변이 aldehyde alcohol dehydrogenase를 만들어 과발현하였다. 그 결과, 포도당을 이용한 실시간 부탄올 회수공정이 포함된 유가식 발효에서 585.3 g의 부탄올을 0.31 g/g의 수율과 1.32 g/L/h의 생산성으로 생산한 것으로 보고하였다. 이후, 다른 연구에서는 아세틸 코에이로부터 부탄올 생합성에 필요한 모든 효소들을 과발현시킨 C. acetobutylicum을 제작하였다[15]. 즉, 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase, thiolase, crotonase, butyryl-CoA dehydrogenase를 암호화하는 hbd, thl, crt, bcd 유전자와 sol 오페론 모두를 과발현시킨 것으로 알려져 있다. 이 균주를 이용한 회분식 포도당 발효에서 지금까지 가장 높은 부탄올 수율 0.34 g/g이 관찰된 것으로 보고하였으나, 농도는 비교적 낮은 14.9 g/L를 보고하였다. 또 다른 연구에서는6-phosphofructokinase와 pyruvate kinase를 암호화하는 pfkA와 pykA 유전자를 과발현한 C. acetobutylicum 균주를 제작하였으며, C. acetobutylicum 회분식 배양에서의 최고 농도인 19.0 g/L 부탄올을 생산한 것으로 보고하였다[16].
부티르산 생산 균주로 잘 알려진 C. tyrobutyricum과 Wood-Ljungdahl 회로를 통해서 syngas 탄소원으로 사용할 수 있는 C. ljungdahlii 를 부탄올 생산용 균주로 개발하기 위한 대사공학 전략 또한 알려져 있다. C. tyrobutyricum 의 경우, ack 유전자를 결실 시킨 후, C. acetobutylicum 의 adhE2 유전자를 pBP1-복제기점을 가진 pMTL82151 플라스미드에 과발현 시키는 대사공학 전략을 보고한 바 있다[17]. 이렇게 개발된 C. tyrobutyricum 균주는 마니톨을 탄소원으로 한 배양에서 0.33 g/g 수율로 20.5 g/L 부탄올을 생산한 것으로 보고하였다. C. ljungdahlii 의 경우는 pIMP1 플라스미드에 ptb 프로모터 아래에 C. acetobutylicum의 thl, hbd, crt, bcd, adhE1 유전자와 butanol dehydrogenase를 암호화하는 bdhA 유전자를 도입하여 부탄올 생합성 균주를 만든 것으로 알려져 있다[18]. 대사공학으로 만들어진 C. ljungdahlii는 합성가스로부터 최대 0.15 g/L 부탄올을 생성한 것으로 알려져 있다.


2.3 에탄올 생산 대사회로 최적화


에탄올은 미국과 브라질에서 가솔린 엔진에 사용되는 바이오 연료 중 하나이고, 최근에는 촉매 공정을 통한 에틸렌글리콜로 전환하여 바이오플라스틱 합성을 위한 전구체로도 일부 사용되고 있다. 포도당으로부터 에탄올 생산은 효모,자이모모나스, 재조합 대장균을 이용하여 생산 가능하다[19]. 최근, 비식용 바이오매스인 목질계 바이오매스 활용을 위한 목적으로 셀룰로오스를 가수분해 가능한 Clostridium 에 대한 관심도 높아지고 있다.
C. acetobutylicum 은 불활성 셀룰로오스 가수분해 효소들을 가지고 있는 것으로 알려져 있지만, 에탄올 생산용 균주 개발을 위한 대사공학 전략이 보고된 바 있다. C. acetobutylicum의 대사회로에서 C4-대사회로에 있는 hbd 유전자를 결실함으로써, 포도당을 이용한 유가식 발효에서 0.38 g/g 수율로 33.0 g/L 에탄올 생산이 가능함을 보고한 바있다[20]. 한편, 셀룰로오스 가수분해능을 가진 C. thermocellum을 이용한 에탄올 생산용 균주 개발은 hypoxanthine phosphoribosyl transferase와 lactate dehydrogenase를 암호화하는 hpt 와 ldh 유전자를 결실시키는 전략을 취하고 있다[21]. 대사공학을 이용하여 만들어진 C. thermocellum 을 이용한 회분식 배양에서, 5 g/L cellobiose로부터 1.0 g/L 에탄올이 생산된 것으로 보고한 바 있다. 또 다른 연구에서, C. thermocellum 의 에탄올 생산 대사흐름을 강화하기 위하여 hpt와 ldh 유전자의 결실에 덧붙여 pta 유전자를 추가로 결실한 바 있다[22]. 동일한 연구에서, 상기 재조합된 C. thermocellum 과 유기산 생합성 대사회로가 차단된 Thermoanaerobacterium saccharolyticum 을 혼합 배양함으로써 92.2 g/L의 셀룰로오스로부터 38.1 g/L의 에탄올을 생성한 것으로 보고한 바 있다.


2.4 이소부탄올 및 2,3-butanediol 생산을 위한 대사공학


이소부탄올은 다른 화합물 합성 전구체로, 2,3-butanediol은 합성고무 제조 공정의 원료 물질로 사용된다. 포도당으로부터 이소부탄올 생산을 위한 대사공학 전략은 이미 대장균에서 알려진 바 있다[23]. 셀룰로우즈를 이용한 이소부탄올 생산을 위한 균주 개발에는 C. celluloyticum 이 이용된 바 있다[24]. 락토코커스 keto acid decarboxylase를 암호화하는 kivd와 바실러스의 acetolactate synthase를 암호화하는 alsS , 대장균의 acetolactate synthase와 alcohol dehydrogenase를 각각 암호화하는 livCD 와 yqhD 유전자를 C. celluloyticum 에 도입하였다. 상기 균주를 이용한 회분식 발효 결과, 셀룰로오스로부터 0.7 g/L의 이소부탄올 생산이 보고되었다. 2,3-Butanediol 생산용 균주개발은 C.acetobutylicum 에 C. beijerinckii 의 acetoin reductase를 암호화하는 acr 유전자를 도입시키는 전략을 취하고 있다[25]. 상기 균주는 acetoin을 전구체로 하여 회분식 발효에서 57.7 g/L의 포도당으로부터 2.0 g/L의 2,3-butanediol을 생산한 것으로 보고하였다.


3. 결론 및 전망


최근 합성생물학 및 시스템생물학 분야의 학문적 발달과 더불어 Clostridium 속 미생물의 대사공학 또한 큰 발전을 이루고 있다. 특히, mobile group II intron 및 CRISPR/Cas 시스템과 같은 게놈 편집 도구와 Clostridium 속 미생물의 대사흐름을 분석하고 예측할 수 있는 게놈 수준 대사네트워크 모델의 개발은 더욱 우수한 균주의 개발을 전망하게한다. 실제로 이들을 활용한 일부 부탄올 생산용 Clostridium 속 미생물 개발에서 괄목할만한 생산성의 발전이 있었다. 향후, 관련 연구에서는 부탄올 생산 공정의 경제성을 담보하기 위한 추가 기술개발이 필요할 것으로 보이며, 현재 개발중인 Clostridium 속 미생물의 대사흐름을 미세조절하기 위한 합성생물학 기반 모듈과 스위치들이 여기에 기여할 수 있을 것으로 확신한다.


                                                                                                             참고문헌
1. Peter Dürre (2005) Handbook on clostridia, CRC press.
2. Jörk Nölling, Breton Gary, Omelchenko Marina V, Makarova Kira S, Zeng Qiandong, Gibson Rene, Lee Hong Mei, Dubois JoAnn,Qiu Dayong, Hitti Joseph (2001) Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum. J Bacteriol. 183; 4823-4838.
3. Changhee Cho, Jang Yu-Sin, Moon Hyeon Gi, Lee Joungmin, Lee Sang Yup (2015) Metabolic engineering of clostridia for the production of chemicals. Biofuel Bioprod Bior. 9; 211-225.
4. Stephen W Ragsdale, Pierce Elizabeth (2008) Acetogenesis and the Wood–Ljungdahl pathway of CO2 fixation. Biochim Biophys Acta - Proteins Proteomics. 1784; 1873-1898.
5. Hyeon Gi Moon, Jang Yu-Sin, Cho Changhee, Lee Joungmin, Binkley Robert, Lee Sang Yup (2016) One hundred years of clostridial butanol fermentation. FEMS Microbiol Lett. 363; fnw001-fnw001.
6. Yu-Sin Jang, Lee Jin Young, Lee Joungmin, Park Jin Hwan, Im Jung Ae, Eom Moon-Ho, Lee Julia, Lee Sang-Hyun, Song Hyohak, Cho Jung-Hee (2012) Enhanced butanol production obtained by reinforcing the direct butanol-forming route in Clostridium acetobutylicum. mBio. 3; e00314-12.
7. Sangwoo Kim, Jang Yu-Sin, Ha Sung-Chul, Ahn Jae-Woo, Kim Eun-Jung, Lim Jae Hong, Cho Changhee, Ryu Yong Shin, Lee Sung Kuk, Lee Sang Yup (2015) Redox-switch regulatory mechanism of thiolase from Clostridium acetobutylicum. Nat Commun.6; 8410.
8. Georg Mohr, Hong Wei, Zhang Jie, Cui Gu-zhen, Yang Yunfeng, Cui Qiu, Liu Ya-jun, Lambowitz Alan M (2013) A targetron system for gene targeting in thermophiles and its application in Clostridium thermocellum. PloS One. 8; e69032.
9. Alan M Lambowitz, Zimmerly Steven (2004) Mobile group II introns. Annu Rev Genet. 38; 1-35.
10. Francisco Martínez-Abarca, Toro Nicolás (2000) Group II introns in the bacterial world. Mol Microbiol. 38; 917-926.
11. Lijun Shao, Hu Shiyuan, Yang Yi, Gu Yang, Chen Jun, Yang Yunliu, Jiang Weihong, Yang Sheng (2007) Targeted gene disruption by use of a group II intron (targetron) vector in Clostridium acetobutylicum. Cell Res. 17; 963.
12. John T Heap, Pennington Oliver J, Cartman Stephen T, Carter Glen P, Minton Nigel P (2007) The ClosTron: a universal gene knock-out system for the genus Clostridium. J Microbiol Methods. 70; 452-464.
13. Martin Jinek, Chylinski Krzysztof, Fonfara Ines, Hauer Michael, Doudna Jennifer A, Charpentier Emmanuelle (2012) A programmable dual-RNA–guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 1225829.
14. Michael E Pyne, Bruder Mark R, Moo-Young Murray, Chung Duane A, Chou C Perry (2016) Harnessing heterologous and endogenous CRISPR-Cas machineries for efficient markerless genome editing in Clostridium. Sci Rep. 6; 25666.
15. Xiaohu Hou, Peng Wanfeng, Xiong Lian, Huang Chao, Chen Xuefang, Chen Xinde, Zhang Weiguo (2013) Engineering Clostridium acetobutylicum for alcohol production. J Biotechnol. 166; 25-33.
16. Jey-R S Ventura, Hu Hui, Jahng Deokjin (2013) Enhanced butanol production in Clostridium acetobutylicum ATCC 824 by double overexpression of 6-phosphofructokinase and pyruvate kinase genes. Appl Microbiol Biotechnol. 97; 7505-7516.
17. Mingrui Yu, Du Yinming, Jiang Wenyan, Chang Wei-Lun, Yang Shang-Tian, Tang I-Ching (2012) Effects of different replicons in conjugative plasmids on transformation efficiency, plasmid stability, gene expression and n-butanol biosynthesis in Clostridium tyrobutyricum. Appl Microbiol Biotechnol. 93; 881-889.
18. Michael Köpke, Held Claudia, Hujer Sandra, Liesegang Heiko, Wiezer Arnim, Wollherr Antje, Ehrenreich Armin, Liebl Wolfgang, Gottschalk Gerhard, Dürre Peter (2010) Clostridium ljungdahlii represents a microbial production platform based on syngas. Proc Natl Acad Sci USA. 107; 13087-13092.
19. D Brandt (1981) Ethanol production by fermentation, Springer, Boston, MA.
20. Dörte Lehmann, Lütke-Eversloh Tina (2011) Switching Clostridium acetobutylicum to an ethanol producer by disruption of the butyrate/butanol fermentative pathway. Metab Eng. 13; 464-473.
21. Ranjita Biswas, Prabhu Sandeep, Lynd Lee R, Guss Adam M (2014) Increase in ethanol yield via elimination of lactate production in an ethanol-tolerant mutant of Clostridium thermocellum. PLoS One. 9; e86389.
22. D Aaron Argyros, Tripathi Shital A, Barrett Trisha F, Rogers Stephen R, Feinberg Lawrence F, Olson Daniel G, Foden Justine M, Miller Bethany B, Lynd Lee R, Hogsett David A (2011) High ethanol titers from cellulose by using metabolically engineered thermophilic, anaerobic microbes. Appl Environ Microbiol. 77; 8288-8294.
23. Shota Atsumi, Hanai Taizo, Liao James C (2008) Non-fermentative pathways for synthesis of branched-chain higher alcohols as biofuels. Nature. 451; 86.
24. Wendy Higashide, Li Yongchao, Yang Yunfeng, Liao James C (2011) Metabolic engineering of Clostridium cellulolyticum for production of isobutanol from cellulose. Appl Environ Microbiol. 77; 2727-2733.
25. Marco AJ Siemerink, Kuit Wouter, Contreras Ana M López, Eggink Gerrit, van der Oost John, Kengen Servé WM (2011) D-2,3-butanediol production due to heterologous expression of an acetoin reductase in Clostridium acetobutylicum. Appl Environ Microbiol. 77; 2582-2588.
26. Ji Eun Woo, Kim Minji, Won Lee Ji, Joo Seo Hyo, Lee Sang Yup, Jang Yu-Sin (2016) Development of Genome Engineering Tools for Metabolic Engineering of Butanol-producing Clostridium Species. Korean Soc Biotechnol Bioeng J. 31; 193-199.