항체 의약품 최신 분석 기술
Date 2018-04-16 17:37:59 페이스북으로 보내기 트위터로 보내기 hit 1,834
고병준
선임연구원
오송첨단의료산업진흥재단 신약개발지원센터
kobjoon@kbiohealth.kr

1. 항체 분석 기술의 중요성


항체의약품의 시장규모는 전 세계적으로 약 1조 달러(2013년 기준)에 달하였으며 지속적으로 시장을 넓혀왔다. 2015년 기준으로 전 세계 의약품 매출 10위내 제품 중에 항체의약품은 6종을 차지하고 있으며, 향후 의약품 시장은 항체의약품을 포함한 바이오의약품이 합성의약품의 비중을 추월할 것으로 예상하고 있다. 2012년부터 2019년까지 특허가 만료되는 100억불 이상의 시장규모를 가진 의약품들이 10개 정도로 단백질 의약품의 바이오시밀러 시장 또한 확대되고 있다. 이에 발맞추어 국외기업뿐만 아니라 국내의 다수의 제약회사들이 항체의약품과 바이오시밀러개발 및 생산에 많은 투자를 하고 있다. 2015년까지 바이오시밀러는 총 5종이 허가를 받았으며 셀트리온, 한화 그리고 삼성바이오에피스가 그 주인공이다[1]. 항체의약품의 개발과정은 타겟 발굴, 후보물질 발굴, 그리고 개발단계로 이루어져 있다. 발굴 단계에서는 약효의 검증 및 독성, 이화학 특성 분석이 기본적으로 수행되어야 하며, 개발 단계의 비허가용/허가용 항체의 경우 생산품의 철저한 물성 및 특성을 분석한다. International Conference on Harmonisation(ICH)이나 Food and Drug Administration(FDA)는 guideline을 제시하여 그에 충족하는 분석을 요구하고 있다. 표 1은 항체 의약품의 특성 및 물성 분석에 필요한 분석법을 정리한 것이다.


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표 1. 항체의약품 특성 및 물성분석에 이용되는 기술

 

항체는 2개의 중쇄사슬과 2개의 경쇄사슬로 구성된 Y자 형태의 구조를 가지고 있다. (그림 1)

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그림 1. 항체 구조 및 LC-MS를 이용한 특성 분석 기술

 

고도화된 LC-MS를 이용한 특성 분석 이전에 기본적으로 항체의 물성을 분석하는 데 여러 가지 방법이 이용되고 있으며, 특히 항체의 응집이나 불순물에 관해서는 MS를 이용하지 않고 UV 또는 FLR 검출기를 이용하여 생산된 항체의 기본적인 특성을 분석한다. 그 외에도 낮은 Resolution의 3차원구조나 Tm값 측정, 그리고 particle size 등도 여러 가지 FT-IR이나 Differential Scannong Calorimeter(DSC), 또는 Micro-Flow Imaging(MFI)등을 통해서 분석을 하고 있다. 여러 가지 분석법을 통해서 항체의약품의 특성을 정확하게 분석하고 허가기관의 요구를 만족시켜야만 동물실험, 비임상, 임상 등의 허가과정을 시작할 수 있다. 위에서 설명한 물성분석 이외에 그림 1 [2]의 오른쪽과 같이 LC-MS를 이용한 항체의 특성분석에 대해 이번 BT News에 자세히 소개하고자 한다.


2. LC-MS를 이용한 특성 분석 기술


LC-MS는 항체의약품 특성분석에 필수불가결한 요소이며, 널리 사용되고 있으나 LC를 이용한 물성분석보다는 그 분석 횟수가 적은 편인데 이는 질량분석기가 아주 고가의 장비이기 때문에 큰 기업이나 소수의 회사만이 이러한 분석 시스템을 구축할 수 있기 때문이다. 이번 호의 BT News에서 총 6가지의 LC-MS 분석기법을 통한 항체의약품 특성분석에 대해 소개하고자 한다.


2.1 Intact Mass Analysis (전분자량 측정)


150 kDa 정도의 항체의 경우, LC-MS 특성분석을 진행하기 전에 전분자량의 측정을 실시하여 항체생산품의 quality를 측정한다. 그림 2와 같이 항체를 chromatogram처럼 분리하고 질량분석기를 통해 분자량을 측정하여 항체가 가진 전분자량을 측정한다. 항체의 경우 중쇄사슬의 CH1 도메인 부분에 각 한 개의 N-glycosylation을 가지고 있기 때문에 N-glycan을 특이적으로 해리시키는 PNGaseF라는 효소를 처리하거나 처리하지 않은 상태에서 측정하고, 이를 통해 대략적으로 어떠한 glycan이 항체에 붙어 있는지를 그림 2. (E),(F)에서와 같이 확인할 수 있다.

 

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그림 2. 전분자량 측정과정: (A) chromatogram, (B) MS 결과, (C) expanded MS, (D) MS 결과로부터 전분자량 계산, (E) avastin전분자량, (F) avastin에 PNGaseF 처리 후 전분자량 

 

최근 항체의 toxiin을 붙이는 Antibody Drug Conjugate(ADC) 연구가 많이 되면서 drug의 위치를 전분자량 측정으로 대략적으로 확인하고자 하는 분석이 시도되고 있다. 환원제를 처리하여 reducing 하고 heavy chain과 light chain을 분리하여 측정하거나, papain 또는 IdeS라는 효소를 통해 Fab와 Fc 부분을 분리하여 측정하면 대략적인 drug의 위치를 알 수 있다. 전분자량의 측정을 통해서 Glycan의 대략적인 정보와 C-말단l의 Lysine 유무 그리고 항체의 quality를 알 수 있어서 항체의 분석을 진행하기 전에 맨 먼저 전분자량을 측정한다.

 

2.2 Peptide Mapping(펩타이드 지도)


Peptide mapping은 항체의 서열이 정확하게 맞는지 확인하고 생산배치별 변화가 없는지 확인하기 위해 항체를 적당한 절단 효소를 이용하여 펩타이드화하고 분리한 다음 UV absorption과 LC-MS를 통해서 확인한다. 항체의 S-S bond를 reducing하고 cysteine을 alkylation한 다음 펩타이드를 분리하면 그림 3과 같이 각각의 펩타이드 조각들이 분리된 것이 펩타이드 지도이며 각각의 peak를 LC-MS를 통해서 동정(Identification)하여 그 서열의 coverage를 확인한다.

 

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그림 3. Avastin의 펩타이드 지도

 

펩타이드 지도는 질량분석기와 UV를 통해 오래전부터 사용되어온 정형화된 방법으로 항체의 서열이 정확하게 존재하는지, N-/C-말단의 변형여부, 이황화 결합위치, 당화위치를 확인하는 데 사용되며, 냉장 또는 냉동 보관에 서열의 변화가 생기는지 확인도 가능하다. 또한 항체의 효능을 잃지 않고 오랫동안 보관하기 위해 제형제를 개발하는데 그 제형제가 얼마나 오래 효능을 유지시키는지 peptide mapping을 통해서 비교하면 쉽게 확인할 수 있다. Peptide mapping을 통해서는 항체의 서열이 정확하게 존재하는지 외부의 조건변화에 따라 서열이 변하는 것을 확인하기 위해서 반드시 수행되어야 할 분석 기법이다.

 

2.3 Glycan Profiling


항체의 경우는 Fc 부분에 2개의 glycan을 가지고 있으며, glycan의 구조가 항체의 약효 및 반감기에 많은 영향을 미친다. 대표적으로 glycan 말단에 sialic acid가 붙어 있으면 간에서 없어지지 않고 체내를 돌게 되어서 그 반감기가 길어진다. Fucosylation은 Antibody Dependent Cell mediated Cytotoxicity (ADCC)를 낮추고 Complement Dependent Cytotoxicity (CDC)를 높이는 역할을 한다. 그 외에도 항체의 folding과 구조에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. [3] 이런 이유로 항체의약품의 glycan의 구조와 함량에 대한 정확한 정보가 요구되고 있다. Glycan은 불행히도 UV에서 흡광이 아주 낮고 질량분석기에서의 이온화가 쉽지 않은 물질이라 chromophore를 붙인 다음 분석하는 것이 일반적이다. 대체적으로 PNGaseF로 glycan을 항체로부터 해리시킨 다음 reducing end에 2-aminobenzamide (2-AB)를 reductive amination 방법을 이용하여 chromophore를 붙인 다음 LC-UV 또는 LC-MS를 통해서 분석한다. 2-AB를 붙이는 방법은 이틀정도의 시료 전처리 과정이 필요하고 많은 샘플양이 필요하여 최근에는 Rapi-Fluor라는 방법을 통해서 chromophore를 붙이는데 이는 15 ug정도의 항체가 필요하고 시료 전처리 시간도 1시간 정도로 줄어든 획기적인 방법이다[4]. 그림 4의 (A)와 (B)에서 보이듯이 Rapi-Fulor와 2-AB의 시그널이 4 ~ 5배 정도의 차이를 보이고 실험에 걸리는 시간 또한 많이 단축되어서 시료간의 오차가 적음을 알 수 있다. 이러한 Rapi-Fluor 방법을 통해서 얻어진 FLR 데이터는 그림 4의 (C), (D)와 같이 fucose/sialic acid 함량과 glycan 구조의 비율을 계산하여 다른 항체와의 차이점을 확인한다. 대체적으로 항체의 경우는 그 생산 세포주와 배양배지 성분에 의해 영향을 받지만 G0F, G1F, G1F’, G2F라 명명된 glycan (그림 4(A)에 빨간색 박스)이 전체 glycan의 9 0%이상을 차지한다.

 

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그림 4. Glycan profiling: (A) Rapi-Fluor, (B) 2-AB, (C) Fuc & NeAuc 함량, (D) 당사슬 양상

 

2.4 Epitope mapping with hydrogen/deuterium exchange (HDX)


항체의 mode of action(MOA)을 규명하고자 할 때, 항원의 어떠한 부위에 항체가 결합하는지를 아는 것은 필수불가결한 요소이다. 항원의 binding site는 주로 HDX를 통해서 밝히고 있으며 그 원리는 다음과 같다. 그림 5의 (A)에서 보듯이 H2O대신 용매를 D2O를 사용하면 시간이 지날수록 Hydrogen과 Deuterium의 교환이 계속적으로 일어나고 질량분석기를 통해서 Deterium이 얼마나 교환이 되었는지 질량값으로 알 수 있다. 일반적으로 단백질 표면은 D2O의 접근이 쉽기 때문에 더 많은 교환이 일어나지만 항원구조 내부는 D2O의 접근이 어려워 적은 양의 교환이 일어난다. 이 원리를 이용하여 항원-항체 복합체의 HDX를 수행하게 되면 항원과 항체가 결합하는 부위는 항원 단독으로 있을 때보다 항체가 결합하는 부분을 구조적으로 막아서 교환이 적게 일어나게 된다. 그림 5(D)와 같이 교환의 정도 차이를 통해서 그 펩타이드 위치를 알 수가 있다. 항원-항체 복합체에서 H/D 교환이 적게 일어난 부분(그림 5(D)의 왼쪽)이 epitope로 결정이 되고, 반대로 복합체에서 교환이 많이 일어난 부분은 항원과 항체의 결합에 의해서 구조상으로 내부에서 외부로 드러난 부분이라고 예측을 할 수 있다. 그림 5의 (B)와 (C)의 경우는 HDX 시험에서 나타는 질량 data의 시간에 따른 변화와 그 데이터를 바탕으로 Deuterium의 교환정도를 그림으로 나타낸 것이다. 이러한 HDX 기술은 low resolution의 구조를 밝히는 것으로서 단백질-단백질 결합 부위를 밝히는 데 유용하게 이용되고 있다.

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그림 5. (A) HDX원리, (B) 시간에 따른 Deutrium 교환양, (C) 펩타이드 교환량 (D) 항원과c omplex 비교

 

2.5 Disulfide bond mapping (이황화 결합 분석)


항체의 이황화결합을 밝히는 것은 단일 구조의 항체가 존재하는 것을 나타내는 척도로써 항체 생산 시 거쳐야할 분석이다. Peptide mapping에서는 항체의 S-S bond를 환원하고 환원된 cysteine이 다시 이황화 결합을 하지 못하도록 IAM을 처리하여 carbamidomethylation을 시킨다. 그런 후에 trypsin 등을 처리하여 펩타이드화 한 후에 분석을 한다. 만약 Peptide mapping과 같은 형태로 분석을 하게 되면 해리된 S-S bond가 어떻게 연결되었는지 확인할 수가 없다. 그래서 이황화결합 분석에서는 reducing을 하지 않고 이황화결합으로 연결된 상태에서 trypsin을 처리하여 peptide들을 분석하고 peptide mapping에서 나온 reducing form과 비교하여 정확한 이황화결합의 위치를 파악한다. 다시 말해 reducing과 non-reducing form의 비교와 non-reducing 된 peptide들의 MS/MS를 통해 확인한다. 두 개의 peptide가 연결된 form은 그림 6(A)에서 빨간색으로 확인이 되지만 reducing에서는 확인이 되지 않는다. 반대로 reducing form은 파란색으로 확인되지만 non-reducing 조건에서는 LC-MS상에 존재하지 않는다. 이를 바탕으로 이황화 결합으로 연결된 peptide를 MS/MS(그림 6 (B))로 확인하고 (C)와 같이 전체적인 이황화 결합을 완성한다. 이러한 실험과정은 잘 셋업이 되어 있으며 항체뿐만 아니라 다른 재조합 단백질에서도 많이 이용되고 있다. 하지만 실험 과정 중에 가장 큰 이슈는 이황화 결합이 높은 pH에서는 shuffling이 자주 일어나기 때문에 trypsin의 최적화된 pH7.4~8.0을 사용하지 않고 shuffling없는 정확한 분석을 위해 trypsin의 효율을 낮추더라도 pH 6.5에서 nonreducing 시험을 진행한다.


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그림 6. (A) Reducing과 non-reducing MS 비교, (B) 이황화 결합된 펩타이드들의 MS/MS, (C) Humira의 이황화 결합

 

2.6 Glycosylation site analysis (당화위치 분석)


항체는 N-glycosylation site는 대체적으로 하나가 존재하기 때문에 그 분석이 용이한 편이다. 주로 두 가지 방법을 통해서 당화위치를 확인하는데 첫 번째의 방법은 PNGaseF를 이용하는 것이다. PNGaseF는 N-glycan을 특이적으로 단백질로부터 분리하는 효소지만 PNGaseF 처리 후에 Asparagine이 aspartic acid로 변환된다. 두 아미노산의 질량차이는 1에 불과하지만 High resolution mass를 통해서는 쉽게 구분이 가능하다. 그림 7(A),(B),(C)처럼 Asn이 Asp로 변환된 것을 크로마토그램 MS, MS/MS를 통해서 확인하면 바뀐 Asp가 당화위치가 된다. 하지만 이러한 방법은 아미노산의 변환이 미리 존재할 수도 있기 때문에 그림 7(D)와 같이 glycopeptide 형태로 분석을 하여 보완한다. PNGaseF를 처리하지 않은 상황에서 trypsin으로 펩타이드화 시킨 다음 HILIC 컬럼으로 분리하여 LC-MS로 분석하면 그림7(D)와 같은 형태로 분석이 되며, 그에 따른 MS 및 MS/MS 데이터를 통해서 펩타이드의 서열과 glycan의 구조를 동시에 분석하면 N-Glycan이 붙은 당화위치를 정확하게 알 수 있다. 비록 항체의 경우는 N-glycosylation이 대체적으로 한 부위에서만 일어나지만 다른 곳에서 생기는 glycosylation을 확인하고 정확한 곳에서 당화가 되었는지를 확인하는 것이 중요하다.

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그림 7. (A), (B) PNGaseF 처리 후 EEQFDSTYR의 크로마토그램과 질량값, (C) EEQFDS TYR의 MS/MS, (D) Glycopeptide 분석

 

3. 연구실 소개


현재 근무하고 있는 오송 신약개발지원센터는 항체의약품 및 신약개발에 있어서 후보물질 발굴단계에 있는 학교 또는 제약회사를 supporting하는 역할을 하고 있다. 발굴에서부터 선도물질 창출 및 최적화를 통한 후보물질 도출과정에 필요한 약효 및 특성 분석 그리고 독성 및 안정성 평가와 생산 시에 필요한 세포주(cell line) 개발과 생산 공정 개발 및 제형개발 연구 등을 수행하고 있다. 특히 제가 소속된 약물성평가지원팀(분석팀)의 경우는 고성능 질량분석기 5대, 크로마토그래피 11대, 그리고 CE 1대를 가지고 항체의약품이나 재조합단백질의 물리화학적 특성 및 물성을 분석하는 일 외에 정량적 분석이 필요한 PK 분석을 질량분석기를 이용하여 수행하고 있다. 위에서 소개한 항체의 특성분석의 경우는 platform화 되어, 학교, 연구소, 제약회사에서 필요한 서비스를 공급하고 있는 실정이다. 그 외에도 LC, CE, 또는 질량분석기를 이용한 여러 가지 서비스를 하고 있으며 새로이 필요한 분석기술을 개발하는 일 또한 수행하고 있다.


4. 전망


위에서 설명한 대로 항체 의약품 분석은 어느 정도 정형화된 기술이며 국내외 많은 CRO업체들이 서비스를 공급하고 있는 실정이다. 하지만 사용 장비 등의 고가격으로 인해 학교나 회사에서 쉽게 구축을 하기 힘들기 때문에 공공기관인 신약센터에서 장비를 구축하고 서비스함으로써 신약 및 항체의약품 개발에 기여하고 있다. 현재 이렇게 정형화된 항체의약품 분석 기술을 package화하여 전체적인 물성 및 특성을 확인하는 방법을 구축하고 있으며, 향후로는 새로운 물질 또는 특별한 분석이 요구되는 부분을 찾아서 분석기술을 개발하는 쪽으로 방향이 정해질 듯하다. 예를 들어 수요는 많지 않지만 O-glycan에 관한 분석과 현재 계속적으로 개발되고 있는 ADC나 이중항체에 특이적으로 필요한 분석기술이 향후에 보강 개발되어야 할 부분이라 고려된다. 

 

참고문헌
1. 서수경외, (2015). “항체의약품 개발 기술 동향” 재조합의약품 전문자료집 6.
2. Beck, A., et al. (2013). “Characterization of therapeutic antibodies and related product.” Anal. Chem. 85(2):715-736.
3. Narula, G., et al. (2016) “Glycosylation in mAb therapeutic products: analytical chracterizatin and impact of process” LCGC, 34(1):34-46.
4. Lauber, M. A., et al. (2015). “Rapid preparation of released N-glycans for HILIC analysis using a labeling reagent that facilitates sensitive fluorescence and ESI-MS detection.” Anal. Chem. 87(10):5401-5409.