CYP 효소의 multi-step cascade 반응 및 전망
Date 2019-04-08 21:01:59 페이스북으로 보내기 트위터로 보내기 hit 64
최권영
교수
아주대학교 환경공학과
kychoi@ajou.ac.kr

1. 서론


Cytochrome P450 (CYP) 효소는 최근 다양한 고부가 가치 바이오 케미컬 생산 연구에 있어서 상당히 각광을 받고 있는 효소 중의 하나이다. CYP 효소는 활성 부위에 heme을 가지며 비활성 C-H 결합에 산소 원자를 도입하는 반응을 촉매하는 효소이다[1]. 1962년 일본의 Sato & Omura가 발표한 논문에 따르면 간에서 유래하는 pigment중 CO와 결합하여 450 nm에서 최대 흡수 파장을 나타내기 때문에 Pigment 450 (P-450)으로 명명되었다[2, 3]. 이후 다양한 CYP 효소들이 보고되었으며, 특히 사람의 간에는 57개의 CYP isomer들이 외부에서 유입되는 화학물질의 해독작용에 관여하는 것으로 알려져 있다[4]. C Y P 효소는 반응 과정에서 위치특이성(regioselectivity) 및 입체특이성(stereoselectivity)을 갖는다. CYP 산화 반응은 안정적인 C-C 결합의 탄소를 활성화 시킬 수 있기 때문에 높은 순도를 요구하는 합성 생화학 반응 및 생변환에 있어서 중요한 역할을 하고 있다. CYP 효소는 수산화 반응뿐만 아니라, C=C의 epoxidation, N- 혹은 S-oxidation/dealkylation, C-C celavage 반응 등 다양한 반응을 매개하는 것으로도 알려져 있다[1]. 이처럼 CYP효소는 다양한반응을 매개할 수 있기 때문에 다양한 기질들이 CYP 효소에 대해 활성이 보고되고 있다. (불)포화 지방산 뿐 아니라, terpenoids, (iso)flavonoids, vitamins, steroids, antibiotics, polycyclic aromatic hydrocarbon, drug, xenobiotics 등 바이오매스에서 복잡한 화학 구조를 갖는 화학물질에 대해서도 활성이 보고되고 있다[5].
CYP 수산화 효소는 기질로서 산소분자와 전자 전달을 위한 환원 조효소인 NAD(P)H를 필요로 한다. 또한 전자 전달을 위한 ferredoxin, ferredoxin reductase와 같은 redox 단백질을 필요로 한다[6]. 전자 전달 시스템(redox protein)에 따라 CYP 효소는 class별로 분류되기도 하는데, 대부분의 미생물 유래 CYP 효소들은 위의 3 component의 전자 전달 시스템을 갖는 class I에 해당된다[6]. 몇몇 미생물 유래의 CYP 효소는 reductase domain이 heme domain과 하나의 단백질에 fusion 형태로 발현되는 자립형(self-sufficient) 형태를 갖기도 한다. 대표적으로는 Bacillus megaterium 유래의 CYP102A1 (BM3) 효소는 대표적인 자립형 CYP 효소이며, 대장균에서 발현이 용이하고 긴사슬 지방산에 높은 turnover rate로 가장 많이 연구된 CYP 효소중의 하나이다[7]. 전자 전달 단백질이 단일 단백질에서 발현되는 장점으로 인하여 지방산 이외의 기질에 대해 활성을 갖도록 다양한 효소 공학 연구들이 보고되어 CYP 구조-활성 연구에 큰 기여를 하였다. CYP 효소의 위치특이적 산화 반응의 장점으로 인하여 큰 각광을 받고 있음에도 전자 전달 단백질, 낮은 효소 활성, 조효소 공급 등의 산업적 수준의 생산 및 응용을 위한 한계 극복 연구가 계속 진행되고 있다. 본 BT News에서는 CYP효소를 이용한 다양한 바이오 케미컬 생산에 대한 최신 연구 및 동향에 대해서 살펴보고자 한다.

 

2. 본론
2.1 지방산 산화 대사
CYP 수산화 효소를 이용한 multistep cascade 반응은 R-OH 반응 산물을 생성하기 때문에, 활성화된 탄소 원자 부위에 연속 효소 반응을 통해 다양한 화학물질들로 전환할 수 있는 장점이 있다. 이는 최근 바이오매스 중 하나로 많이 이용되는 식물유 유래 바이오매스로부터 고부가 가치 생화학 물질을 생산하는 연구에도 적용이 된다. 구체적으로는 긴 사슬 지방산의 바이오매스를 기질로 하여 CYP효소 반응을 통해 오메가 산화반응과 오메가 수산화 지방산의 ADH(alcohol dehydrogenase), ALDH (aldehyde dehydrogenase) 효소에 의한 연속적인 산화 반응을 통해 양 말단에 acid 작용기를 갖는 diacid로의 전환이 가능하다. 이러한 diacid는 윤활유, 계면활성제, 가소제, 고분자 단량체와 같은 산업용 바이오케미컬로 응용이 가능하다. 일례로, diacid를 고분자 단량체로 사용하여 diamine과 반응하여 polyamide의 nylon 고분자 생산으로 응용이 가능하다. CYP 효소 중 CYP102A 계열의 자립형 CYP 효소들이 이러한 지방산 오메가​ 산화 대사에 관여하는 것으로 보고되었으나, 오메가 2, 3위치에 위치특이성이 높고 오메가 말단의 산화 활성이 낮기 때문에, 최근에는 알칸 산화대사에 관여하는 CYP52 혹은 CYP153A 계열의 CYP효소와 AlkB (alkane monooxygenase)효소를 이용하는 연구 결과들이 보고되었다[7-9]. 최근 생명공학연구원의 연구 결과에 따르면 효모를 이용하여 C12의 methyl laurate로부터 약 92.5 g/L의 diacid를 생산한 연구 결과가 보고되기도 하였다[10] .

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그림 1. CYP 기반 지방산 오메가 산화와 연속적 효소 반응을 통한 지방산 유도체 화합물 생산 [9,10]


CYP-ADH-ALDH 연속 반응과 더불어 CYP-ADH-ωTA (transaminase)의 연속적 효소반응은 지방산으로부터 상당히 흥미로운 생변환을 매개한다. 최종 반응 산물은 오메가 아미노 지방산으로 nylon PA 12의 monomer로 응용할 수 있는 화학물질이다. 석유기반의 화학적 PA12 생산 공정은 C4로부터 연속적인 촉매 반응이 필요하며 가스상 반응으로, CYP 기반의 연속 효소 반응은 이를 대체할 수 있는 바이오 공정으로 가능성이 높다[11]. 최근 연구 결과에 따르면 CYP 연속 효소 반응을 통한 지방산에서 diacid로의 over-oxidation 활성이 높기 때문에 ωTA 효소의 알데히드 기질 전환까지의 활성을 확보하는 것이 주요한 연구 한계 중 하나이다[12]. 뿐만 아니라, 지방족 알데히드를 아민 수용체의 기질로 활성이 있는 ωTA 효소를 확보하는 것과 아민 공여체를 공급하여 일정 수준의 농도를 확보하는 연구도 필요하다.

 

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그림 2. CYP-ADH-TA 연속 효소 반응을 통한 chiral amine 합성 연구 결과 [13]


CYP 기반 지방산 산화 대사와 동일한 연속 산화 반응으로 의약 전구 물질 생산에서 중요한 stereoselective chiral amine을 도입한 연구 결과가 보고되었다[13]. 이는 CYP 산화 산물이 1차 알콜이 아닌 2차 알콜이기 때문에, ADH 산화 반응 산물이 알데히드가 아닌 케톤의 반응 산물을 얻을 수 있다. CYP-ADH-TA 효소의 연속 cascade 반응을 이용하여 benzylic amine (e.e.>97.5%)을 위의 그림과 같이 stereoselective C-H amination을 촉매할 수 있는 wholecell biocatalyst 시스템을 구축하는 연구가 보고되었다.

 

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그림 3. CYP-ADH-aminase 연속 효소 반응 및 조효소 balance [14]


CYP-ADH cascase 연속 반응의 장점은 전세포 반응에 있어서 중요한 NAD(P)H 조효소 밸런스를 맞출 수 있다는 점이다. CYP-FDH (formaldehyde dehydrogenase) 효소 커플링을 통해 NADH 조효소를 재생산하고, ADHReductive aminase 커플링을 통해 NADPH 조효소를 재생산하는 시스템 도입을 통해 cycloalkane으로부터 chiral amine을 2 g/L/d (19.6 mM) 수준으로 생산에 성공한 연구가 보고되었다[14].

 

2.2 아미노산 유도체 화합물 산화 대사
세포내 CYP효소 도입 세포내 아미노산 전구체 산화를 유도하여 산업적으로 유용한 바이오케미칼을 생산한 연구 결과도 보고되고 있다. 일례로 아미노산 대사산물을 기질로 하는 CYP 효소 반응의 한 예로 바이오 인디고 생산을 들 수 있다. 최근 친환경 바이오 소재 및 공정 기술 개발에 관심이 증가되면서, 바이오 indigo 생산과 같이 바이오매스로부터 생변환의 공정 기술 개발 역시 각광받고 있다. 이 반응에서 L-tryptophan은 대장균에서 tryptophanase (TnaA)효소의 가역적 반응을 통해 indole로 전환된다. 대장균에 자립형 CYP102G4 효소를 도입하게 되면 세포내 indole을 기질로 indole C3 위치 특이적으로 수산화 잔기를 도입할 수 있다. 그리고 연속적인 oxidation 반응을 거쳐 3-hydroxyindole은 self-dimerization을 통해 청바지 염료인 indigo 색소로 전환된다[15].

 

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그림 4. L-tryptophan으로부터 TnaA-CYP-Oxidase 연속 반응을 통한 indigo 색소 생합성 [15]


바이오 indigo 생산은 비단 CYP102G4 효소 뿐 아니라 FMO (flavin monooxygenase), NDO (naphthalene dioxygenase) 등 oxygenase 효소도 동일한 활성이 있는 것으로 보고되었다[16]. 효소기반의 바이오 indigo 생산은 전구 물질인 L-tryptophan 혹은 indole 기질을 추가적으로 공급 혹은 세포내 생합성 증대가 필요하기 때문에 L-tryptophan의 공급과 L-tryptophan에서 indole로 전환되는 가역 반응의 tryptophanase 효소 반응의 활성을 높이는 것 역시 해결해야 하는 연구 관건이다.


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그림 5. TxtABCDE 효소 반응을 통한 Thaxtomin A 생합성 경로 [17]

 

최근 식물 병원성 균주인 Streptomyces turgidiscabies 에서 phytotoxin인 thaxotomin A의 생합성 경로를 규명한 연구 결과에 따르면 thaxotomin의 코어 구조는 L-phenylalanin과 L-4-nitroryptophan의 중합반응을 통해 형성되는 것으로 밝혀졌다[16]. 이 경우 L-4-nitrotryptophan의 합성은 TxtE CYP 효소가 L-arg로부터 전달된 NO를 L-tryptophan에 nitration반응에 관여하여 생합성 하는 것으로 밝혀졌다. 이후 TxtABC 효소들에 의해서 최종적으로 thaxtomin A로 전환된다. 이러한 TxtE와 유사한 CYP 효소는 S. turgidiscabies 외에 S. scabies, S. acidiscabis 균주 등에서 보고되기도 한다. Thaxotomin A 생합성 과정에서는 말단의 수산화 반응을 위한 TxtC의 CYP 효소가 추가적으로 관여한다. 전체적인 TxtABCDE operon을 통한 생합성 반은 TxtD를 통한 L-arginine으로부터 NO의 공급, ATP, SAM (S-adenosylmethionine) 의존적인 dimerization 반응, NADPH 조효소 공급 등 다양한 변수에 대한 최적화 연구가 필요하다.


2.3 천연물 산화
지방산과 아미노산 유도체 화합물 생변환과 더불어 CYP 효소는 다양한 천연물의 산화에 관여한다. 특히 몇몇 천연물의 CYP 산화 반응은 수산화 작용기와 같은 친수성 잔기의 도입은 용해도 증가와 더불어 항산화, 항염, 항암 등의 생리적을 증대시키는 것으로도 알려져 있다. 일례로 콩과류에 함유되어 있는 daidzein, genistein, equol 등 isoflavonoids 화합물은 C4’, C7 위치에 수산화 잔기가 존재하며, CYP 효소 반응을 통해 C3’, C6, C8의 ortho-위치특이적으로 수산화 잔기를 도입함으로써 catechol 구조를 갖는 hydroxyisoflavonoids를 생합성 할 수 있다[18]. 이러한 위치특이적 수산화 반응은 천연물의 항산화 효능을 상당히 증대시키기 때문에 다양한 생리 활성 바이오 소재로 응용이 가능할 것으로 생각된다.

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그림 6. daidzein의 CYP 효소 기반 위치특이적 수산화반응 및 O-MT/O-GT 구조 변형

 

일반적으로 isoflavonoids 수산화 반응에 관여하는 CYP 효소는 식물유래 CYP는 기존에 보고되었으나 대장균에서 발현 및 낮은 활성의 문제로 인하여 미생물 유래 CYP 수산화 효소를 개량하여 isoflavonoids에 위치특이적 수산화 반응 활성을 증대시키는 효소 개량 연구가 많이 진행되었다. Streptomyces, Nocardia, Bacillus, Pseudomonas 유래의 다양한 CYP 수산화 효소 개량을 통해서 isoflavone의 위치특이적 수산화 반응 연구 결과들이 보고되었다[18]. Isoflvaone 이외에도 chrysin, apigenin의 flavonoids, curcumin, phloretin의 chalcone계 화합물에 대해 활성이 있는 CYP 효소 개량 등의 연구가 보고된다[18]. 이러한 천연물의 위치특이적 수산화 반응은 연속적인 O-methyltransferase 혹은 O-glycosyltransferase 효소반응을 통해 다양한 구조적, 화학적 물성 변화를 유도할 수 있기 때문에 다양한 생리활성을 갖는 천연물 유도체 화합물을 생산할 수 있다는 장점이 있다. 뿐만 아니라, 최근 천연물 기반 CYP 효소 연구는 식물 및 곤충 유래 CYP 효소를 활용하려는 연구가 많이 시도되고 있다. 다양한 식물 및 곤충의 genome sequnencing이 완료되고 CYP 유전자 정보를 확보할 수 있고, 이러한 CYP 유전자의 recombinant 시스템을 이용한 발현 시스템 및 전자 전달 시스템의 이해, 활성 증대 등 연구를 통해 천연물의 생리 활성을 증대시키는 것이 가능하다.

 


3. 결론


CYP 효소는 위치특이성 산화 반응과 다양한 반응 매개로 인해 산업적으로 상당히 유용한 효소임에는 틀림이 없다. 그러나 이 효소를 이용하여 산업적으로 유용한 수준으로 바이오케미컬을 생산한 사례는 그리 많지 않다. 앞서 언급한 효모를 이용한 C12 diacid 생산, 말라리아 치료제로 알려진 arteminisin과 그 전구체인 amorphadiene의 25 g/L와 40g/L 수준의 생산 결과들이 보고되어 있으나[19], CYP 수산화 효소의 실용화 수준의 생산성 증대를 위한 연구는 여러 측면에 있어서 엔지니어링 전략을 통해 극복해야 할 난제들이 있다. CYP-Fdx-FdR의 전자 전달 시스템의 극복은 CPR (cytochrome P450 reductase) 단백질과 fusion 시스템 구축, natural photosystem 이나 electron mediator를 이용한 전자 전달 시스템의 활용의 엔지니어링 결과들이 보고되었다. 낮은 효소 활성 증대 및 기질 특이성 변화를 위한 CYP 효소의 directed evolution은 2018년 노벨 화학상을 수상한 Caltech의 Frances arnold 교수의 주요 업적 중의 하나이다[20]. 세포내 조효소 생산 증대 및 조효소 재생산 시스템 도입 연구 역시 이러한 CYP 효소의 낮은 활성 한계를 극복하고자 하는 연구 중의 하나이다.
또한, 최근에는 CYP 효소를 산업적 수준으로 의미있는 바이오케미컬 생산의 chemo-enzymatic 공정을 응용한 연구 결과들도 보고되었다[21]. 이 연구에서는 6-iodotetralone을 기질로 하여 화학 합성으로 높은 순도의 광학이성질체를 얻기 힘들기 때문에 CYP102A1 효소 반응을 통해 고순도의 (R)-알콜을 생합성하고 후반부에는 금속 촉매를 이용하여 높은 광학 순도를 갖는 synthon을 합성한 생물-화학 융합 공정에 응용한 연구 성과 중의 하나이다.
CYP 효소가 발견된 1958년 이후 60여 년 동안 CYP 연구는 급진적인 발전을 이루었다. 효소 반응 메커니즘의 이해에서 CYP 효소를 이용한 생산 수준의 연구까지 다양한 연구 결과들이 축적되어 왔다. Directed evolution의 효소 개량연구와 공정 연구와 융합되어 석유 기반의 화학물질 생산을 대체할 수 있는 생물공학 기술로 발전해 왔다. 향후 미생물 이외 다양한 식물, 곤충 등 CYP 유전 정보와 반응에 대한 이해와 더불어 합성 생물학 기술의 발전과 융합하여 난제로 여겨지는 CYP 효소 한계를 극복할 수 있을 것으로 기대한다.

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그림 7. CYP 생촉매-Pd 촉매의 생물-화학 융합 공정 기술 연구 결과 [20]

 

 

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