잠자는 세균(Sleeping bacteria)과 항생제(antibiotics)
Date 2019-04-08 21:22:56 페이스북으로 보내기 트위터로 보내기 hit 208
김준섭
전임연구원
한국생명공학연구원 감염병연구센터
junkim83@kribb.re.kr

‘잠자는 숲속의 미녀’ 라는 동화가 있다. 요정의 저주를 받은 공주가 ‘물레’에 찔려 영원한 잠에 빠지게 되고 이후 왕자의 ‘키스’를 받아 잠에서 깨어나 왕자와 결혼하여 잘 살았다는 내용이다. 재미있는 점은 실제 요정의 저주는 물레에 찔려 ‘죽는’ 것이었으나, 다른 요정들의 도움을 받아 ‘죽지 않고 살아남기’ 위하여 ‘잠’에 빠지게 된다. 재미있게도 자연계에도 비슷한 현상이 존재한다. 외부에서 치명적인(lethal) 스트레스(stress)가 왔을 때 세균(bacteria)들은 죽음(death)을 선택하는 대신 휴면상태(dormant)로 들어가 버티다가 외부 스트레스가 사라졌을 때 다시 깨어나 분열을 하는 선택을 한다. 이러한 현상은 세균들에게 가장 강력한 스트레스인 항생제(antibiotics)가 처리되었을 때 두드러지게 나타난다.
1928년 알렉산더 플레밍(Alexandar fleming)의 페니실린(penicillin) 발견[1]은 인류 역사상 가장 큰 발견 중 하나였으며 항생제 시대(antibiotic era)의 시작을 의미하였다. 이후 인류는 세균성 감염병의 공포에서 해방될 수 있었다. 페니실린은 제 2차 세계대전 중 화려하게 등장하여 스포트라이트를 받았으며 수 만명의 병사들의 생명을 구한 뒤, 마법의 탄환(magic bullet)이라 불리며 감염병으로부터 인류를 지켜줄 최강의 무기로 사람들의 뇌리 속에 남았다. 최근에는 항생제 내성균(resistant) 및 슈퍼박테리아(super-bacteria)라 불리는 다제내성균(multi-drug resistant)의 급속한 출현에 의해 큰 위기가 찾아 왔지만 여전히 세균성 감염병을 ‘효과적으로’ 치료할 수 있는 유일한 방법은 항생제뿐이다.
대부분의 항생제는 자연산물(natural product)이다. 즉, 자연계에서 미생물들이 서로 경쟁하는 가운데 사용되는 무기가 항생제이고 인류는 이를 발견하여 의학적으로 사용해 온 것이다. 이곳에서 항생제의 맹점이 생겨난다. 수십억년 동안의 진화를 거쳐서 현재에 이른 미생물들이 방어체계도 만들어냈다. 전공자가 아닌 일반인도 알고 있는 현상인 ‘항생제 내성(antibiotic resistance)’이다. 실제로 페니실린이 실제 의료 현장에서 쓰이기 시작한 1943년 보다 이전인 1940년에 이미 페니실린에 대해 내성을 가지는 세균이 발견되었다[2]. 그렇다면 긴 시간동안 진화를 거친 세균들의 방어책이 항생제 내성 하나 뿐일까?

 


발견(Finding)


70여년전, 두 과학자가 초기 페니실린의 작용기작 연구 중 재미있는 현상을 발견하였다. 1942년 의사인 Gladys L.Hobby는 Streptococci에서 페니실린의 기전을 연구하던 중 페니실린을 과량으로 오랫동안 처리하더라도 1% 정도의 세균이 계속적으로 살아남는 것을 확인하였다[3]. 2년 뒤인 1944년, Joseph W. Bigger는 동일한 연구를 더욱 발전시켜 살아남는 1% 세균이 항생제 내성과는 다른 현상이며 휴면상태를 유지함으로써 항생제에 대해 살아남는다고 보고하였다. 그는 이 현상을 내성(resistance)과 구별하기 위하여 저항성(persistence)이라는 용어를 사용하여 설명하였다[4].


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그림 1. 항생제 저항성 현상의 특징. (A) 내성과는 다르게 저항성은 항생제를 이겨내고 자라지 않는다. (B) 항생제에 감수성 개체군과 저항성인 개체군이 공존하기 때문에 두 단계 사망곡선 (biphasic killing curve)을 그린다. (C) 항생제 저항성 개체군을 다시 배양하더라도 자녀 세포들은 항생제에 감수성을 보이며 동일하게 저항성 개체군은 적은 양 관찰된다. (D) 이러한 이유로 세균의 개체군 수는 항생제 유무에 따라 진공 곡선(oscillation curve)을 그린다. 본 그림은 참고문헌 [5, 72-29] 에서 발췌함.


이러한 저항성에는 몇 가지 큰 특징이 있다(그림 1). (i) 항상 적은 수만 살아남는다(0.1~0.001%). (ii) 이렇게 살아남은 세균들은 내성균이 아니다. 살아남은 세균들을 모아서 다시 배양한 뒤 항생제를 처리하면 대부분의 세균들은 사멸하고 다시 적은 수만 살아남는다. (iii) 즉, 형질이 유전되지 않는다(non-inheritable). 저항성 개체군(persister population)은 항생제가 사라지면 쉽게 항생제 감수성(susceptible)으로 변하고 그 자녀 세포(progeny)들 역시 항생제 감수성을 보인다. 저항성 개체군의 유전적 배경(genetic background)은 세균에 의해 사멸되는 대부분의 개체군과 동일(identical)하다. 그렇기에 내성 유전자를 획득하거나 돌연변이에 의해 생기는 항생제 내성과는 그 궤를 달리한다. 이러한 특징 때문에 표현형적 변종(phenotypic variant)이라고도 불린다. (iv) 항생제 존재하에서 항생제의 능력을 이겨내고 생장(growth)할 수 있는 내성균과는 다르게 저항성 개체군은 죽지도 생장하지도 않는다. 즉, 항생제 존재하에서는 휴면(dormant)상태로 존재한다. (v) 일반 세균이 저항성을 띠게 되면, 서로 다른 기전을 가지고 있는 여러 항생제들에 대해 모두 살아남을 수 있게된다(multi-drug persistence)[5].

안타깝게도 1940년대에 처음으로 현상이 발견된 이후, 40여년간 세균의 이 멋진 현상은 사람들의 뇌리에서 잊혀졌다. 1983년에 Moyed에 의해 이러한 현상이 세균의 염색체(chromosome) 안에 존재하는 toxin-antitoxin (TA) 시스템과 연관이 있다는 사실이 밝혀지고[6] 다시 10여 년간 연구가 되지 않다가 2000년에 들어 저항성 현상이 생물막(biofilm)이나 만성 감염병(chronic disease)과 연관이 있다고 밝혀지면서 수면 위로 떠올랐다[7].



기작(Mechanisms)


초기 저항성에 대한 연구는 대부분 그 기작이 무엇인지 알아내는 것에 초점을 두었다. 그 결론에는 대부분 TA 시스템이 존재하고 있었다. Moyed의 HipA/HipB [6] 시스템을 시작으로 MqsR/MqsA [8], TisB/IstR-1 [9], YafQ/DinJ[10] 등 여러 가지 TA 시스템이 저항성의 형성에 영향을 미친다는 것이 밝혀졌다. 기본적으로 TA 시스템은 쌍으로 존재하고 있는데, 일반적인 조건에서는 toxin과 antitoxin이 같이 발현되고 toxin이 antitoxin에 의하여 억제되어 아무런 문제가 되지 않지만 어떠한 이유에 의해서 toxin의 양이 더 많아지면 toxin에 의해 세균이 사멸하거나 세균의 성장이 억제된다[11]. 일례로 가장 먼저 발견된 TA 시스템인 ccdA/ccdB의 경우 toxin인 ccdB의 경우 염색체 상에, antitoxin인 ccdA의 경우 플라스미드 상에 존재하여 분열 중 플라스미드를 잃어버리는 세포는 toxin에 의해 사멸되어 플라스미드의 안정성을 유지하는 데 기여한다[12]. 즉, 저항성은 세균의 toxin과 antitoxin의 불균형에 의해 toxin의 양이 많아 지고 다시 toxin에 의해 DNA의 복제(replication), 전사(transcription), 번역(translation) 등이 억제되고 결과적으로 세균이 휴면상태로 들어가게 되면서 항생제에 대해 살아남을 수 있다. 신기하게도 대부분의 TA 시스템은 toxin과 antitoxin이 모두 한 염색체 상에 같이 존재한다. 그렇다면 이들은 어떻게 불균형이 일어날 수 있을까?
이후 연구자들은 항생제가 처리되었을 때 어떠한 기작으로 TA 시스템의 불균형이 일어나는지 연구하였다. 결론적으로 여러 복합적인 반응들이 합쳐져서 TA 시스템의 불균형을 만든다는 것이 밝혀졌다. 몇 가지 예를 들면, 첫 번째로 항생제는 세균의 입장에서는 외부 스트레스다. 이러한 스트레스는 세균의 DNA에 데미지를 주게 되는데 복구 시스템인 RecA가 이에 반응하게 되고 RecA는 다시 TisB(toxin)를 과다 발현 시켜서 휴면상태로 이끈다. 다른 예로는 역시 세균의 스트레스 반응에 주로 반응하여 만들어지는 ppGpp 와 같은 alarmone이 세균 내부에 쌓이게 되고, 이 ppGpp는 master protease인 Lon을 활성화 시키고 활성화된 Lon이 TA 시스템의 antitoxin을 분해함으로써 불균형이 일어난다는 것이다(그림 2).

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그림 2. 항생제 저항성 형성 기작. (A) 일반적으로 스트레스 반응에 의한 TA 시스템 활성화 후 휴면 상태로 들어가면서 항생제에 대해 저항성이 생김. 이러한 휴면 상태의 세균은 항생제가 사라진 뒤 다시 깨어나게 되며 생장을 시작함. (B) 이외에도 최근에는 휴면 상태 이외의 방법이 항생제 저항성 형성에 영향을 미친다는 연구 보고도 존재함. 본 그림은 참고문헌 [28] 에서 발췌함.​

 

​2010년대에 들어 이러한 이론은 도전을 받게 된다. 여러 연구 그룹에 의해 저항성을 보이는 개체군이 TA 시스템에 의한 완벽한 휴면상태가 아니라 세균의 호흡(respiration), 펌프(efflux pump), 약물 타깃 불활성화(drug target inactivation) 등 다른 요인에 의해서 일어날 수 있다는 것이 확인되었다(그림 2). 물론 이러한 변화는 유전적 변형에 의해서 고착화된 것이 아닌 유전자의 확률적(stoichastic) 발현 노이즈(expression noise)에 의함이다. 즉, 저항성은 내성과 달리 유전되지 않는다라는 기본 명제는 계속적으로 지켜진다.

 

 

문제(Problems) 

 

세균 감염병 중 만성(chronic)이거나 항생제 치료에 의해서도 완벽하게 치료되지 않는 경우가 있다. 저항성 단계(persisting stage)로 들어간 세균이 항생제가 사라진 뒤 깨어나(resuscitation) 재분열을 하는 현상이 세균 감염병의​ 치료를 어렵게 만든다는 것은 여러 논문에서 다뤄져 왔다(그림 3) [13, 14]. 몇몇 동물 모델을 통해 Salmonella, E. coli, M. tuberculosis 등이 in vivo 에서도 저항성을 보여 살아남는다는 것이 확인되었으며[15-20], 기주 세포 안에 들어간 세균이 항생제에 대해 높은 저항성을 갖게 된다는 것[21]이나 대식작용(phagocytosis)에 의해 대식세포(macrophage)안에 들어간 경우에도 저항성 개체군의 형성이 증가한다는 것이 확인되었다(그림 3) [18]. 또한 항생제에 주기적으로 노출된 환자에서 분리된 임상균주의 경우 일반 균주에 비해 저항성 개체군 형성 빈도가 훨씬 높아져 있음이 확인되었다[22].

 

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그림 3. In vivo 에서의 항생제 저항성. (A) 항생제 저항성 개체군이 깨어나 일반 항생제 감수성으로 변하는 요인. (B) 실제 in vivo 상에서 항생제 저항성은 in vitro 상에서보다 더 높다. 본 그림은 참고문헌 [30]에서 발췌함.


저항성 현상은 또한 항생제 내성의 출현과도 밀접한 연관이 있다. 일반적으로 항생제 내성 출현은 세균 유전자의 자연변이(spontaneous mutation)에 의해 무작위로 변이가 생기게 되고 이때 항생제가 처리됨으로써 항생제에 내성을 갖는 변이체(mutants)들만 살아남음으로써 내성 출현이 가속화 된다라는 것이 하나의 정설이었다. 하지만 최근에는 항생제 저항성으로 인해 살아남은 세균들이 오랫동안 항생제에 노출되고 이로 인한 스트레스 반응에 의해 세균 유전자의 변이가 가속화 되고 이로 인해 항생제 내성의 출현 확률이 훨씬 높아진다는 보고들이 나오고 있다(그림 4) [32-26].

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그림 4. 항생제 저항성과 내성 출현의 관계. 최근 연구에 따르면 항생제 저항성으로 인해 항생제에 노출된 세균이 살아남게 되고 이러한 세균들이 궁극적으로 항생제 내성으로 발전함을 제시하고 있다. 

 

 

결론(Conclusion) 

 

선사시대부터 시작된 인간과 세균의 싸움은 항생제의 개발 이후 인간의 승리를 확신했지만 세균은 생각보다 많은 방어기작을 가지고 있다. 항생제 내성뿐 아니라 저항성이라는 강력한 무기를 가지고 있는 세균은 전 세계 인류의 큰 위협이 되고 있으며 항생제 내성의 경우 현재 전 세계적으로 내성균 감염으로 인한 사망자수가 70만명에 이르고 있으며 2050년경에는 1000만명에 이를 것이라 관측되고 있다. 이번에 소개한 항생제 저항성 현상의 경우 만성 감염병과 함께 항생제 내성 출현의 가속화의 원인으로 지목되고 있으며 많은 연구자들의 관심을 받고 있다. 최근에는 이러한 항생제 저항성을 줄이거나 없애기 위한 여러가지 기술들이 개발되고 있다. 본 연구자는 항생제 저항성의 형성 기작 및 제어 기술 개발 연구를 하고 있으며, 이를 통해 항생제 내성 출현을 최소화 하여 인류의 건강을 증진시키는 데 이바지하고자 한다.

 

참고문헌
1. Fleming, A., On the antibacterial action of cultures of a penicillium, with special reference to their use in the isolation of B. influenzae. 1929. The British Journal of Experimental Pathology, 1929: p. 226.
2. Abraham, E.P. and E. Chain, An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. Rev Infect Dis, 1940. 10(4): p. 677-8.
3. Hobby, G.L., K. Meyer, and E. Chaffee, Observations on the Mechanism of Action of Penicillin. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 1942. 50(2): p. 281-285.
4. Bigger, J., TREATMENT OF STAPHYLOCOCCAL INFECTIONS WITH PENICILLIN BY INTERMITTENT STERILISATION. The Lancet, 1944. 244(6320): p. 497-500.
5. Lewis, K., Persister cells. Annu Rev Microbiol, 2010. 64: p. 357-72.
6. Moyed, H.S. and K.P. Bertrand, hipA, a newly recognized gene of Escherichia coli K-12 that affects frequency of persistence after inhibition of murein synthesis. J Bacteriol, 1983. 155(2): p. 768-75.
7. Brooun, A., S. Liu, and K. Lewis, A dose-response study of antibiotic resistance in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Antimicrob Agents Chemother, 2000. 44(3): p. 640-6.
8. Kim, Y. and T.K. Wood, Toxins Hha and CspD and small RNA regulator Hfq are involved in persister cell formation through MqsR in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun, 2010. 391(1): p. 209-13.
9. Dorr, T., M. Vulic, and K. Lewis, Ciprofloxacin causes persister formation by inducing the TisB toxin in Escherichia coli. PLoS Biol, 2010. 8(2): p. e1000317.
10. Harrison, J.J., et al., The chromosomal toxin gene yafQ is a determinant of multidrug tolerance for Escherichia coli growing in a biofilm. Antimicrob Agents Chemother, 2009. 53(6): p. 2253-8.
11. Unterholzner, S.J., B. Poppenberger, and W. Rozhon, Toxin-antitoxin systems: Biology, identification, and application. Mob Genet Elements, 2013. 3(5): p. e26219.
12. Tam, J.E. and B.C. Kline, The F plasmid ccd autorepressor is a complex of CcdA and CcdB proteins. Mol Gen Genet, 1989. 219(1-2): p. 26-32.
13. Bjarnsholt, T., The role of bacterial biofilms in chronic infections. APMIS Suppl, 2013(136): p. 1-51.
14. Lebeaux, D., J.M. Ghigo, and C. Beloin, Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics. Microbiol Mol Biol Rev, 2014. 78(3): p. 510-43.
15. Adams, K.N., et al., Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell, 2011. 145(1): p. 39-53.
16. Blango, M.G. and M.A. Mulvey, Persistence of uropathogenic Escherichia coli in the face of multiple antibiotics. Antimicrob Agents Chemother, 2010. 54(5): p. 1855-63.
17. Claudi, B., et al., Phenotypic variation of Salmonella in host tissues delays eradication by antimicrobial chemotherapy. Cell, 2014. 158(4): p. 722-733.
18. Helaine, S., et al., Internalization of Salmonella by macrophages induces formation of nonreplicating persisters. Science, 2014. 343(6167): p. 204-8.
19. Kaiser, P., et al., Cecum lymph node dendritic cells harbor slow-growing bacteria phenotypically tolerant to antibiotic treatment. PLoS Biol, 2014. 12(2): p. e1001793.
20. Manina, G., N. Dhar, and J.D. McKinney, Stress and host immunity amplify Mycobacterium tuberculosis phenotypic heterogeneity and induce nongrowing metabolically active forms. Cell Host Microbe, 2015. 17(1): p. 32-46.
21. Schumacher, M.A., et al., HipBA-promoter structures reveal the basis of heritable multidrug tolerance. Nature, 2015. 524(7563): p. 59-64.
22. Mulcahy, L.R., et al., Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol, 2010. 192(23): p. 6191-9.
23. Levin-Reisman, I., et al., Antibiotic tolerance facilitates the evolution of resistance. Science, 2017. 355(6327): p. 826-830.
24. Novak, R., et al., Emergence of vancomycin tolerance in Streptococcus pneumoniae. Nature, 1999. 399(6736): p. 590-3.
25. Sebastian, J., et al., De Novo Emergence of Genetically Resistant Mutants of Mycobacterium tuberculosis from the Persistence Phase Cells Formed against Antituberculosis Drugs In Vitro. Antimicrob Agents Chemother, 2017. 61(2).
26. Vogwill, T., et al., Persistence and resistance as complementary bacterial adaptations to antibiotics. J Evol Biol, 2016. 29(6): p.1223-33.
27. Cohen, N.R., M.A. Lobritz, and J.J. Collins, Microbial persistence and the road to drug resistance. Cell Host Microbe, 2013. 13(6): p. 632-42.
28. Harms, A., E. Maisonneuve, and K. Gerdes, Mechanisms of bacterial persistence during stress and antibiotic exposure. Science, 2016. 354(6318).
29. Lewis, K., Persister cells, dormancy and infectious disease. Nat Rev Microbiol, 2007. 5(1): p. 48-56.
30. Fisher, R.A., B. Gollan, and S. Helaine, Persistent bacterial infections and persister cells. Nat Rev Microbiol, 2017. 15(8): p. 453-464.