합성 mRNA 소개 및 백신으로서의 활용
Date 2021-04-21 14:50:35 페이스북으로 보내기 트위터로 보내기 hit 2,977
임성은 / 최보금 / 조현진 / 이혁진
학부생 / 학부생 / 학부생 / 부교수
이화여자대학교 약학대학
6425750@naver.com / choibgmm10@gmail.com / hjwgod1919@naver.com / hyukjin@ewha.ac.kr

1. 서론 


코로나 19시대를 맞이하면서, 독일의 바이오앤테크 (BioNtech)과 미국의 모더나(Moderna)를 필두로 mRNA를 기반으로 한 신속 백신 개발 (rapid vaccine development)이 화두가 되고있다. 기존 RNA 치료제가 다양한 유전병 및 난치 질환 치료를 위해 개발이 된 것과는 다르게, 대량의 백신 접종을 위해 RNA 치료제가 개발된 것은 인류 역사상 처음이다. 합성 mRNA (In vitro transcripted (IVT) mRNA) 는 기존의 plasmid DNA vector 를 대체하기 위해 개발된 RNA 물질로서 세포 내 특정 (Target) 단백질을 발현시키는 목적으로 이용될 수 있다. 이러한 특정 단백질은 치료용 단백질 및 전사인자, 백신 항원 등이 될 수 있으며, mRNA 의 물리적/화학적 특성상 빠른 단백질 발현 및 소실을 유도할 수 있다. 본 기고문에서는 합성 mRNA 의 구조 및 제작 방법, 그리고 백신으로서 응용 (vaccine applications)에 대해 소개하고자 한다. 또한 mRNA 백신을 인체에 안전하고 효과적으로 전달할 수 있는 이온화 지질나노입자에 대한 중요성을 이야기 하고자 한다.

 

2. mRNA의 구조 및 IVT mRNA 제작방법

 

2.1. Cap 기반 mRNA 구조 및 구성요소 (그림1)


mRNA는 5’말단과 3’말단으로 구분되며, 5’말단에서부터 번역이 개시된다. 5’말단은 변형된 구아닌(G) 뉴클레오타이드의 나열로 이루어진 5’ cap구조로 시작된다. 3’말단에는 아데닌 뉴클레오타이드 50~250개로 이루어진 poly A-tail 구조가 형성되어 있다. 이는 5’ cap구조와 함께 mRNA의 말단을 이루며 가수분해효소에 의해 분해되지 않도록 보호해주며, mRNA의 안정성과 번역 효율을 높이는 데에 매우 중요한 역할을 한다 [1]. 5’말단과 3’말단에 존재하는 UTR (untranslated region)은 단백질로 번역되는 부위는 아니지만, 리보솜 부착 등의 중요한 역할을 한다. ORF (open reading frame)은 단백질이 암호화된 영역이다. 개시 코돈을 시작으로 단백질 번역이 이루어지며 종결 코돈을 마지막으로 번역이 종료된다.

 

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그림 1. mRNA의 구조 및 구성요소 

 


2.2. IVT mRNA의 합성


 IVT mRNA는 plasmid DNA를 주형으로 하여 세포 밖에서 합성된다. 주형 DNA에는 5’ cap구조를 제외한 나머지 mRNA구조에 대한 정보가 암호화되어 있다. 이를 주형으로 T7 RNA polymerase는 뉴클레오타이드를 중합해 mRNA를 만들어나간다. 대부분의 IVT mRNA에서 5’말단과 3’말단의 UTR은 α-, β-globin UTR을 사용하여 안정성과 번역 효율을 높일 수 있다. 다음으로 IVT mRNA에서 cap을 도입하는 방법에는 크게 2가지가 있는데, 첫 번째 방법으로는 바이러스 유래의 capping 효소를 이용하는 방법이다. 이는 자연 상에 존재하는 진핵세포의 cap구조와 가장 유사하게 만들어낼 수 있다는 장점이 있다. 두 번째로는 미리 합성된 cap 유사구조체를 IVT 과정에서 추가해주는 방법이다. 마지막으로 mRNA 합성이 끝난 후에는 mRNA만 남기기 위해 주형으로 쓰였던 DNA는 DNase로 분해시키고, purification을 통해 만들어진 IVT mRNA만을 추출해낼 수 있다.

 

2.3. Cap 디자인의 다양화 및 화학적 수식이 도입된 IVT mRNA 


 mRNA의 여러 구조를 변형시킴으로써 안정성과 번역 효율을 높일 수 있다. 먼저 다양한 cap design을 예로 들 수 있다. 현재 ARCA (anti-reverse cap analogues)라고 하는 구조가 널리 이용되고 있다. 하지만 이 방법은 전사 과정에서 GTP 뉴클레오타이드와 경쟁하여 cap 구조가 형성되지 않은 mRNA가 나올 수 있다는 단점이 있다. 이를 보완한 새로운 구조가 바로 CleanCap이다. 더 높은 capping 효율로, 단백질 발현율을 높일 수 있다는 장점이 있다.

 Poly A-tail 구조 합성에는 크게 세 가지 방법이 있는데, 첫 번째로는 IVT mRNA의 template가 되는 DNA 벡터에 tail PCR 을 통해 poly T를 도입함으로써 3’ poly A-tail 구조를 합성할 수 있다. 두 번째로는 IVT mRNA가 만들어진 후에 재조합 poly A 중합효소를 이용하여 3’말단에 poly A-tail 구조를 도입하는 방법이다. 마지막으로는 ribose-modified adenosines, cordycepin 등 화학적으로 변형된 아데노신을 이용하는 방법이다. 이는 mRNA가 더 오래 유지되도록 하며 in vitro, in vivo 모두에서 번역 효율을 높이는 방법으로 알려져 있다.

 마지막으로는 화학적 변형 구조를 가진 뉴클레오타이드의 이용이다. IVT mRNA에서 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드를 사용하면 면역반응으로 이어지는 TLR 신호전달을 방해할 수 있으며, RNase에 대한 저항성을 가지게 된다.

 

3. IVT mRNA 백신 개발 및 응용 


​3.1. 세포 내 mRNA 의 항원 발현


 mRNA 백신 이전에 개발된 기존 백신은 바이러스를 사멸시키거나 독성을 약화시켜 인체에 주입한다. 하지만 mRNA 백신은 바이러스의 항원 단백질을 암호화하는 mRNA를 주입하여, 기존 백신에 비해 감염 확률이 없고 낮은 비용으로 생산이 가능하다. mRNA 백신은 우리 몸이 바이러스의 항원 단백질을 생성하는 방법을 학습하도록 한다. 따라서 이후에 같은 바이러스가 침입했을 때, 이전에 학습한 결과를 토대로 신속하고 효율적으로 바이러스를 제거할 수 있게 된다.

 mRNA 백신은 주로 근육 내로 주사한다. mRNA가 세포 안으로 전달되면, mRNA로부터 단백질을 만드는 기구인 리보솜에 의해 단백질로 번역된다. 생성된 단백질은 실제로 사용되지 않기 때문에 필요 없는 단백질로 인식이 되어 세포는 단백질에 유비퀴틴을 붙인다. 이는 몸에서 사용되지 않는 단백질을 분해하여 처리하는 프로테아좀으로 유도하는 역할을 한다. 유비퀴틴화가 된 단백질은 프로테아좀에 의해 분해가 되고, 일부 펩타이드가 TAP 수송체에 의해 조면소포체 안으로 능동적으로 수송된다.

 소포체로 들어간 펩타이드는 일반적인 세포의 경우, MHCⅠ과 결합하여 세포막으로 수송된다. 대식세포나 수지상세포와 같은 항원제시세포 (APC)인 경우, MHCⅠ뿐만 아니라 MHCⅡ에도 펩타이드를 결합시켜 세포막에 수송한다. 결과적으로 세포는 표면에 바이러스가 가지고 있던 단백질의 일부인 항원을 MHC와 함께 표지 하게 된다. 따라서 mRNA 백신은 바이러스의 단백질을 발현시키고, 세포막에 노출된 단백질은 이후 바이러스 감염을 예방할 수 있는 기억세포를 생성하도록 면역반응을 유도하게 된다.

 

3.2. mRNA 백신 면역유도 기전: 체액성 및 세포성 면역 (그림2) 


 근육으로 주입된 mRNA와 mRNA가 번역되어 나온 결과물인 단백질은 외부 물질이기 때문에 몸에서 면역반응을 유도한다. 1차 면역 반응이 일어나고, mRNA가 단백질로 번역됨과 동시에 일부 mRNA는 빠른 시간 내에 분해된다. 세포내에서 만들어진 단백질은 항원 펩타이드-MHCⅡ 복합체의 형태로 세포막에 발현되고, 이를 인식한 helper T cell 이 활성화된다. 세포는 세포를 직접 사멸시키는 세포독성T세포와 항체를 만들어내는 B세포를 활성화하여 본격적인 2차 면역반응이 시작된다. 활성화된 세포독성T세포는 항원이 제시되어 있는 MHCⅠ을 인식하여 기존 체내에서 생성되는 단백질이 아닌 바이러스 항원이 결합되어 있는 경우, 해당 세포를 터뜨린다 [2,3].

 놀랍게도 우리 몸에는 항원에 노출되기 전부터 이미 굉장히 다양한 항원을 인식할 수 있는 능력을 가진 B세포가 존재한다. 이러한 B세포는 표면에 APC가 제시하는 항원을 인식할 수 있는 항체를 지니고 있다. 따라서 항원을 제시하고 있는 대식세포가 혈액을 통해 mRNA 백신이 주입된 근육조직에서 골수 및 비장으로 이동하고, B세포와 접촉하게 된다. 대식세포가 제시한 항원과 알맞게 결합할 수 있는 항체를 가진 B세포는 활성화되어, 다량의 중화항체를 생성하고 혈액으로 방출한다. 항체는 몸속에 있는 항원을 인식하고 응집시켜 세포내 침투를 못하게 한다.

 이때, 시간이 지나면서 T 세포와 B 세포는 각각 인식한 단백질 항원을 기억할 수 있는 기억세포를 생성한다. 이 기억세포는 이후 같은 바이러스가 침입했을 때, 이에 대한 기억으로 재빠르게 바이러스에 대항하는 세포독성T세포와 B세포를 형성할 수 있다. 따라서 바이러스가 증식하여 몸의 항상성을 깨뜨리기 전에 감염된 세포를 죽이고, 침입한 항원을 무력화하여 바이러스 감염으로부터 몸을 보호할 수 있다.

  


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그림 2. (a) B세포의 체액성 면역 (b) T세포의 세포성 면역  

 


4. 체내 mRNA 전달을 위한 지질나노입자 개발


​4.1. 이온화 지질나노입자 및 구성성분


 mRNA는 온도 등 주변 환경에 매우 민감하다. 그리고 몸속에 RNA들을 분해시키는 여러 가지 효소들이 존재하기 때문에 mRNA 백신을 몸에 주입했을 때 항체와 같은 특정 단백질들의 생성을 유도하기까지는 다양한 신체 환경으로부터 안정하게 물질을 유지시킬 수 있는 무언가가 필요하다. 따라서 음전하를 띠고 분자량이 큰 RNA를 세포막을 통과시키고 RNA 분해 효소로부터 보호시킬 수 있는 기술이 계속해서 개발되고 있다.

 그중 지질나노입자 (lipid nanoparticle, LNP) 기술이 가장 널리 쓰이고 있다. 지질나노입자는 여러 다양한 종류의 물질들을 혼합시켜서 만든다. 입자의 주된 구성 성분으로는 인지질과 이온화 가능한 지질들이 있고 이 혼합물들이 세포막과 융합하여서 RNA를 전달하는 역할을 한다. 콜레스테롤은 지질나노입자의 안정성을 유지시켜 주며 RNA가 세포질로 이동하게끔 도와준다. 폴리에틸렌글라이콜 (PEG, polyethylene glycol)은 입자의 친수성을 높여주고, 비특이적 단백질 흡착을 막아 지질나노입자가 체내에서 긴 시간 머무를 수 있게끔 도와준다.

 LNP의 주요 특징 중 하나는 상대적으로 중성 표면 전하를 띠는 것이다. 이 특징은 LNP에 다른 혈청 단백질이 흡착하는 것을 막아준다는 장점이 있다. 흡착이 많이 일어날 경우는 혈액 속 돌고 있는 대식세포의 축적을 일으키고 따라서 특정 조직으로 들어가는 것에 영향을 미치게 되기 때문에 중성 전하를 유지하는 것이 중요하다 [4]. 하지만 DNA와 RNA 등의 음전하를 띠고 있는 고분자들을 LNP 시스템에 넣을 때에는 양전하와의 정전기적 인력이 필요하기 때문에 주로 LNP에 ionizable 지질을 넣어준다.

 여기서 주의할 점은 넣어준 지질이 영구적으로 양전하를 띠면 앞서 설명한 것처럼 다른 단백질과 ‘complex’를 형성하기 때문에 1,2-dioleoyl-3-dimethylammonium propane (DODAP)같은 ionizable지질을 사용해야 된다. 이를 사용함으로써 낮은 표면 전하로 높은 encapsulation 효율을 얻을 수 있다. DODAP은 pKa < 7을 가진 지질로써 낮은 pH (pH 4)에서는 음전하를 띠고 있는 RNA을 잘 봉입할 수 있으며 체내 pH 환경(pH 7)으로 가면 pH가 높아지므로 중성을 띠게 된다.

 

4.2. 이온화 지질나노입자의 응용 (그림3) 


 지질나노입자 (LNP) 기술은 mRNA 백신개발 플랫폼으로 개발되고 있지만 아직까지는 이를 전달하는 데에는 어려움을 겪고 있다. 최근 화이자와 바이오엔테크가 개발한 코로나19 백신이 최근에 규제 당국의 문턱을 넘었다. 코로나 백신 ‘BNT162b2’에 대해 지난 12월에 영국 의약품건강관리제품규제청 (MHRA), 미국 식품의약국 (FDA), 유럽 의약품청 (EMA)이 긴급사용승인 (EUA)을 했고 이제 mRNA 백신으로 접종이 본격화되고 있다.

 mRNA 백신은 실제 바이러스를 약화시키거나 불활성화 시켜서 만드는 예전의 전통적인 백신과 달리, 바이러스 겉의 Spike 단백질을 만드는 유전자 지시들이 포함되어 있는 RNA 로 만들어진다. Spike 단백질은 바이러스 외피에 돌기처럼 뻗어 나와 있는 물질로, 바이러스가 다른 세포에 침투할 때 사용이 된다. 이 유전 물질이 주사를 통해 사람의 세포안으로 들어가서 spike단백질을 만들게 되면, 세포가 바이러스에 침투한 줄 착각하게 되고 면역 반응을 한다. 그런데 만약 세포 속으로 들어간 RNA가 혈액 속에 있는 Rnase와 같은 효소에 노출되면 spike 단백질이 생성되기 전에 분해되고 만다.

 따라서 이 현상을 막기 위해 mRNA를 지질나노입자 (LNP)에 봉입하여 전달시킨다. 미국 Arbutus Biopharma 의 LNP 개발 기술은 이미 특허로 등록 되어 있다. Moderna는 Arbutus Biopharma 의 ‘069특허’를 무효화해 달라고 주장을 했으나 기각되었고, 따라서 이온화지질을 기반으로 한 LNP 원천기술의 확보가 중요시되고 있다. 현재까지 알려진 백신들의 보관 조건을 보면, Pfizer백신의 영구 보관 조건이 영하 70도, 반면 Moderna는 영하 20도에서 약 6개월 정도 보관이 가능하다.

 Alnylam Pharmaceuticals의 RNAi 치료제 온파트로 (Onpattro)는 유전자 침묵 (gene-silencing) 기술을 이용한 RNAi 치료제로서 2018년 FDA의 허가를 받았다. 온파트로는 희귀 신경손상질환의 일종인 유전성 ATTR 아밀로이드증 (hereditary ATTR amyloidosis) 환자에게 처방되고 있는 약이다. 온파트로는 유전자가 변형됨으로써 비정상적 TTR (Transthyrtin) 단백질이 간 내 만들어지는 과정에 작용해서 TTR 아밀로이드가 말초신경과 심장 등의 조직에 축적되는 것을 막아주는 기전을 가지고 있다. 이온화 지질인 DLin-MC3-DMA, helper lipid (distearoylphophatidylcholine, DSPC, 콜레스테롤)과 poly(ethylene glycol) (PEG)등으로 만들어진 LNP가 앞서 설명한 유전성 ATTR 아밀로이드증 환자에서 siRNA 전달할 때 사용된다.

 

 

 

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그림 3. 이온화 지질의 화학적 구조 (a) Moderna L5 (b) Dlin-MC3-DMA 

 

 

4. 결론


 mRNA 치료제 및 백신은 기존 단백질 의약품을 대체하기 위해 개발되었으나, 다양한 질병에 신속 대응할 수 있는 장점을 기반으로 차세대 핵산 치료제의 대표주자가 될 것으로 기대되고 있다. 이러한 mRNA 치료제는 유전병 및 난치질환 치료뿐만 아니라, 향후 감염병 및 암 치료 백신 등으로 발전해 나갈 것이다. 코로나 대응을 위해 개발된 covid mRNA 백신의 경우, 세계최초 상용화까지 1년 이내의 기간이 걸렸으며 현재 가장 많은 인류가 단기간 접종한 백신으로 기록될 예정이다. 앞으로도 다양한 신종 감염병의 위협으로부터 인류를 보호할 중요한 수단으로 mRNA 백신이 이용될 것이다. 특히, 국내에서도 관련분야 연구자와 제약사의 노력으로 mRNA 백신의 국산화에 박차를 가하고 있으며, 곧 그 결실 얻어질 것으로 기대된다.


5. 참조


1. Kwon H, Kim M, Seo Y, Moon YS, Lee HJ, Lee K, Lee H. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 2018 Feb;156:172-193. doi: 10.1016/j.biomaterials.2017.11.034.

2. Lee K, Kim SY, Seo Y, Kim MH, Chang J, Lee H. Adjuvant incorporated lipid nanoparticles for enhanced mRNAmediated cancer immunotherapy. Biomater Sci. 2020 Feb 21;8(4):1101-1105. doi: 10.1039/c9bm01564g.

3. Lee K, Kim TS, Seo Y, Kim SY, Lee H. Combined hybrid structure of siRNA tailed IVT mRNA (ChriST mRNA) for enhancing DC maturation and subsequent anticancer T cell immunity. J Control Release. 2020 Nov 10;327:225-234. doi: 10.1016/j.jconrel.2020.08.009. 

4. Kim M, Jeong M. and Lee H. Engineered ionizable lipid nanoparticles for targeted delivery of RNA therapeutics into different types of cells in the liver. Science Adv. 2021 Feb 26; doi: 10.1126/sciadv.abf4398