1. 서론 ​

   과학의 발전과 더불어 다양한 항암치료제가 개발되어 왔다. 1세대 항암치료제는 세 포에 독성을 유발하는 전통적인 화학요법으로써 Platinum 기반 약물, Paclitaxel, Doxorubicin 등을 포함한다. 이후, 나노 물질의 Enhanced Permeation and Retention (EPR) 효과 또는 항체의 Ligand-Receptor 결합 효과를 이용하여 1세대 항암치료제의 치료 효율을 높이고 부작용을 낮출 수 있는 표적항암요법이 2세대 항암치료제로써 개 발 및 활용되고 있다 [1]. 최근에는 환자 내부의 면역 반응을 조절하여 암세포를 제거 하는 Oncolytic virus, Chimeric Antigen Receptor T cell (CAR-T), Immune Checkpoint Blockade (ICB, 면역관문 억제제)가 3세대 항암치료제로 개발되어 사용 중이다 [2]. 물 질 또는 재료적인 측면에서 1세대 항암치료제는 소분자 화합물(Small molecular chem ical)로, 2세대 항암치료제는 소분자 화합물 및 고분자/항체 복합체로, 3세대 항암치료 제는 항체, 단백질, 세포로 구별될 수 있다. 하지만 각 항암치료제들은 기전에 의거한 작동 장소 측면에서도 확연한 차이를 보인다. 

   1세대 항암치료제는 세포 내부 소기관들의 기능을 방해하여 세포분열을 방지함으 로써 세포를 사멸시키는 물질들이 대다수이다. 예를 들어, Paclitaxel은 Microtubule의 Depolymerization을 방지함으로써 세포가 정상적으로 분열할 수 없게 하며, Platinum 기반 약물 및 Doxorubicin은 세포 분열에 필요한 DNA synthesis를 방해하는 것이 주요 기전으로 제시된다 [3], [4]. 2세대 항암치료제는 1세대 항암치료제가 선택적으로 암 조직에 도달 후 암세포에 전달되도록 하기 위하여 Tumor MicroEnvironment (TME)에 있는 EPR과같은 혈관 구조 및 Receptor 발현 환경을 이해하고 이를 활용한다 [5]. 3세 대 항암치료제의 경우 생체 내 특정 면역 세포를 분화 및 활성화시키고 TME 내에서 해당 면역 세포들이 작동하도록 개발된다 [6]. 따라서 3세대 항암치료제의 개발을 위해서는 면역 치료의 전주기적 과정에서 포괄적인 조직학적 이해가 필요하다. 

   면역 치료의 전주기적 과정은 다음과 같다 (그림 1). 1세대 및 2세대 항암치료제에 활용되는 소분자 화합물 중 일부 와 방사선 치료는 Immunogenic cell death (ICD)를 불러일으킬 수 있다. ICD란, 항암치료제에 의하여 암세포의 Necrosis 과정을 유도될 때 Calreticulin (CRT), ATP, High Mobility Group Box 1 (HMGB1)이라고 하는 인자가 노출되는 과정을 말한다. ICD에 의한 인자들은 주위의 비성숙화된 Dendritic cell (Immature dendritic cell, imDC)를 죽은 암세포 주위로 불러오게 하며, imDC는 암세포 또는 암세포 항원을 포식하여 분해하며(Processing) 활성화되게(Activation) 된다. 이를 통해 성숙화된 Dendritic cell (Matured DC, mDC)는 CD8+ T cell를 교육, 분화, 활성화하며, CD8+ T cell은 혈액을 돌아 다니면서 항원-특이적으로(Antigen-Specific) 암세포를 감지해 사멸을 유도한다 [7]. 이러한 면역 과정에서 면역관문 억 제제(aCTLA-4; antibody to Cytotoxic T-Lymphocyte Associated protein 4, aPD-1; antibody to Programmed cell Death protein 1, aPD-L1; antibody to Programmed cell Death-Ligand 1, aLAG-3; antibody to Lymphocyte-Activation Gene 3) 는 mDC에서 CD8+ T cell을 교육시키는데 도움이 되며, 동시에 암세포가 CD8 T+ cell에 의한 공격을 회피하는 기전을 방해하는 역할을 한다 [8]. 

   면역 치료의 전주기적 과정에서 CD8+ T cell이 항암 면역치료 효율의 주요 인자이기에 T cell의 교육, 분화, 활성화하 는 조직에 대한 이해가 필요하다. 연구결과에 따르면 성인 70 kg 기준, 사람의 몸은 3X1013개의 세포로 구성되어 있고, 그중 면역 세포가 약 6%를 차지하고 있다. 면역 세포의 40%는 원기 세포((Progenitor cell)의 생성 장소인 골수에 위치 하며, 그 다음으로 많은 약 39%의 면역 세포는 림프절(Lymph node)에 존재한다 [9]. 림프절이란, 림프관 사이에 위치한 1 cm 정도 되는 결절로 전신에 분포하여 네트워크를 형성하는 림프계에 속하는 조직이다. 생리학적으로 림프절은 조직으로부터 나온 혈액 내 물질을 모으고 옮기면서 항상성을 유지시키고, 자가 면역 및 바이러스 감염과 같은 광범위한 병 리학에 관여하는 역할을 한다. 특히, 림프절은 앞서 면역 치료 과정에서 핵심적인 역할을 하는 Dendritic cell (DC) 및 T cell의 대다수가 존재하는 장소이자, DC이 T cell을 교육, 분화, 활성화시키는 전체적인 과정이 발생하는 공간이다 [10] [12]. 즉, 림프절 내로 항암 면역치료제의 효율적인 전달을 통해 DC이 T cell을 교육하는 과정을 인위적으로 상승시킬 수 있다면, 3세대 항암치료제의 항암치료 효율을 높일 수 있을 것으로 기대된다. 따라서 본 기고문에서는 항암 면역치 료제의 효율 향상을 위한 림프절 약물전달 시스템의 개발에 대한 최신 기술 동향에 대해 소개하고자 한다. 

2. 본론

2.1. 림프절 매개 항암 면역 치료의 가능성

   임상에서 허가받은 3가지의 항암 면역치료제 중 면역관문 억제제란, 면역관문과 관련된 면역체계의 억제 경로를 차 단하여 "① T cell의 교육, 분화, 활성화를 촉진"시키고, "② 암세포의 면역 회피 기전을 막음"으로써 암을 치료하는 항암 면역치료제의 일종이다 [8]. 2011년 최초로 aCTLA-4 면역관문 억제제가 FDA에서 승인을 받은 후, 지금까지 aPD-1, aPD-L1, aLAG-3가 승인을 받았으며, 이에 대한 공로로 2018년 James P. Allison과 Tasuku Honjo 교수가 2018년 노벨 생리의학상을 수상하기도 했다. 또한, 2016년 이후부터 면역관문 억제제는 그 적응증이 확장되어 흑색종과 폐암 외에 도 방광암, 신장암, 두경부암, 림프종, 간암 등 다양한 암종에 대하여 추가 승인을 받았다. 그럼에도 불구하고, 면역관문 억제제는 낮은 환자 반응률 및 면역 폭풍과 같은 독성이 문제점으로 지목되고 있다 [13]. 

   면역관문 억제제는 정맥주사(IntraVenous injection, i.v.) 및 복강투여(IntraPeritoneal injection, i.p.)와 같은 전신투여 (Systemic administration) 방식을 통한 항암 면역치료제로 허가를 받았다. 이는 암세포가 CD8 T+ cell에 의한 공격을 회 피하는 기전을 방해하는 면역관문 억제제의 효능을 극대화하기 위해 암세포가 존재하는 TME로 약물을 전달하기 위한 투여 방식이었다. 하지만 생체 내 많은 일반 세포들도 면역 세포에 대한 비특이적 공격을 회피하기 위하여 면역관문을 발현하고 있기에, 면역관문 억제제의 전신투여는 부작용을 일으키기도 한다. 특히 전신투여 방식은 DC이 T cell을 교육, 분화, 활성화시키는 장소인 림프절로의 물질 전달 효율이 낮은 것으로 알려져 있어, 면역관문 억제제의 2가지 기능 중 "① T cell의 교육, 분화, 활성화를 촉진"과 관련된 기능은 효율적으로 활용하지 못하는 방식이기도 하다.

   조지아공과대학교의 Susan N. Thomas 그룹은 림프절 내 면역관문 억제제의 전달이 항암 면역치료 효율에 미치는 영향을 확인하는 연구를 수행하였다. 같은 양의 면역관문 억제제를 각각 복강투여(i.p.), 암으로의 직접 주입 (IntraTumoral injetion, i.t.), 암과 멀리 떨어진 피하주입(Subcutaneous injection ContraLateral to the tumor, c.l.), 암과 가 까운 피하주입(Subcutaneous injection IpsiLateral to the tumor, i.l.) 한 이후에 약물의 조직 분포를 확인하였다. 그 결과, i.p.와 c.l.의 경우 경우 TME 및 암과 연결되어 있는 림프절(Tumor Draining Lymph Nodes, TDLN)에 약물이 전달되지 않았으나, i.t.의 경우는 TME 및 TDLN에, i.l.은 TDLN에 주로 약물이 전달되었다. 이때 TDLN에 전달된 면역관문 억제 제의 양은 i.l.과 i.t.가 차이가 없었다. 동물 종양모델에서 i.p.와 c.l. 은 면역관문 억제제의 효능이 나타나지 않았으나, i.l.과 i.t.는 높은 항암 면역치료 효능을 보였고 두 투여 방식에 따른 치료 효능 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 해당 연 구 결과는 적응 면역 반응에 중요한 장기인 림프절이 실제로 항암 면역치료제의 주요 타겟 조직이며, 림프절로의 항암 면역치료제의 전달만으로도 충분한 항암 효과를 낼 수 있다는 것을 시사하였고, 이는 림프절 약물 전달체 개발의 기점이 되었다 [13].

2.2. 림프절 전달 과정 

   항암 면역치료제의 효율적인 림프절 전달을 달성하기 위해서는 적응 면역 반응, 림프계 및 림프절의 구조 및 이동과 정에 대한 전반적인 이해가 필요하다 (그림 2).

​

   DC 및 Macrophage가 포함된 Antigen-Presenting Cell (APC)는 항원을 탐식 후 성숙이 이루어지고, Processing 한 항 원을 세포막 MHC class II에 발현(Presenting)한다. 이때, 말단 조직(Peripheral tissue)에 위치하던 성숙화된 APC는 ExtraCellular Matrix (ECM)에 존재하는 One-valve system인 림프관을 따라 Chemotaxis에 의해 림프절로 이동하게 되 고, Immature T cell과 B cell에게 항원을 제시함으로써 교육, 분화, 활성화시킨다. 성숙한 APC뿐만 아니라 각종 항원 및 면역치료제들도 림프관을 따라 직접적으로 림프절로 흘러갈 수 있다. 이때, 항원 및 약물의 입장에서 APC의 도움으로 림프절로 이동하는 과정을 Active transport라고 하며, 세포들의 도움 없이 직접 ECM 내 용액 흐름(Interstitial flow) 및 림프액 흐름(Lymphatic flow)에 편승해서 림프절로 이동하는 과정을 Passive transport라고 한다 [14]-[16].  

   Active transport와 Passive transport 중 어떠한 과정을 통해 항원 및 면역치료제들이 림프절로 도달하는지는 해당 물 질의 크기, Rigidity, 그리고 표면전하에 의해서 결정된다. 10 nm 이하의 물질이 피하주입될 경우, 대다수는 빠르게 혈액 으로 이동하게 된다. 그에 비하여, 10-100 nm의 물질은 Intestitial flow에 편승하여 ECM 내 구멍(Pore)를 관통함으로써 Passive transport를 통해 림프관으로 효율적으로 도달한다고 알려졌다. 반면 200 nm 이상의 물질은 ECM의 구멍을 관 통하지 못하고 구멍에 걸려 있게 되므로 Passive transport가 쉽지 않다. 따라서 보통 200 nm 이상의 물질은 APC에 의한 Active transport를 통해서 림프절로 도달하게 된다. 크기 의존적 림프절 이동 과정은 물질의 단단함에 영향을 받는다. 고분자 및 마이셀, 리포좀과 같이 Flexible한 유기 나노 물질의 경우와 달리, Polystyrene 및 Silica nanoparticle과 같은 Rigid한 나노 물질은 비록 사이즈가 10-100 nm일지라도 ECM 내 구멍을 효율적으로 투과하지 못하여 Passive transport에 의한 림프절 전달 효율이 떨어지게 된다 [17], [18]. 또한 ECM 을 구성하는 세포들의 막에 존재하는 Phosphate group으로 인해 ECM은 음 전하를 띠므로, 양전하를 띠는 물질은 ECM과의 정전기적 인력으로 인해 Passive transport가 효율적으로 일어 나지 못한다. 반면에, 양전하를 띠는 물질은 APC의 세포막과 정전기적 인 력으로 만나 탐식되기 쉬우므로 Active transport에 유리한 측면이 있 다. 그럼에도 불구하고, 너무 강한 양 전하는 세포막에 손상을 주어 독성을 유발하며, 생체 내 다양한 음전하 단백질과 응집 현상을 유발하기에 림프절 전달에 적합하지 않다. 실제 비교 연구에 따 르면 약한 음전하를 가진 나노 입자는 중성 및 양전하를 띠는 나노 입자보다 림프절에 더 많이 전달된다고 알려져 있다 [17]-[21]. 요약하면, 물질을 효율적으로 림프절에 도달하게 하기 위해서는 물질의 크기, Rigidity, 표면전하를 조절해야 한다. 다만, 피하 주입된 모든 물질은 Active transport와 Passive transport 모두를 통해 림프절로 이동하게 되며, 물질의 특성에 따라 한 가지 과정을 좀 더 선택될 뿐이다.

   림프관으로 들어온 항원 및 면역치료제는 림프액에 편승하여 림프절로 도착하게 된다. 림프절은 상피세포와 상주 DC 등으로 구성된 SubCapsular Sinus (SCS)로 덮여 있고 SCS가 캡슐 내에 추가로 둘러싸이는 다수의 림프 소엽으로 구성 된 콩과 같은 구조를 하고 있다. 림프절은 SCS를 기준으로 가까운 부분부터 Cortex, Paracortex, Medullar로 구분할 수 있다. 림프절에서 Immature B cell과 Immature T cell은 각각 뭉쳐져 있는데, Immature T cell은 Paracortex에 국한되어 T cell zone을 형성하는 반면, Immature B cell은 Cortex 부분에 존재하여 B cell follicle을 구성하고 있다. 림프절에서 SCS 는 상피세포와 상주(Resident) DC 및 Macrophage로 구성되어 있으며, Afferent lymphatic vessel를 통해 림프절로 도달 한 림프액 내의 항원이 림프절에 대기하는 B cell과 T cell을 무조건적으로 활성화시키는 것을 방지하기 위한 Barrier 역 할을 한다. 따라서 림프절 내부의 T cell의 효율적인 교육, 분화, 활성화를 위해서 항원 및 면역치료제는 SCS를 통과하 여야 한다. SCS를 통과하여 림프절 내부의 Cortex, Paracortex, Medullar로 물질이 전달되는 대표적인 경로로는 물질을 탐식한 APC들이 직접 SCS 구성 세포 사이를 뚫고 지나가는 Propelling, SCS 구성 세포에 의한 물질의 Transcytosis, SCS 구성 세포 사이의 Conduit를 통한 물질의 이동이 있다. 이 중 Conduit는 Fibroblast Reticular Cells (FRCs)과 Collagen으로 구성되어 있는 작은 관으로써 림프절 내부를 관통하여 퍼져 있는 형태를 가지고 있기에, 물질을 림프절 내로 효율적으로 전달할 수 있는 대표적인 경로이다. 그러나 Conduit은 70 kDa 이하 즉, 5-8 nm의 물질만 통과할 수 있 는 특징을 가지고 있다.

   요약하면, 피하주입을 통한 림프절로의 물질 전달은 크게 두 단계로 나뉜다. 첫 번째는 피하주입부터 림프관까지의 도 달하는 단계로써, 10-100 nm 사이의 크기를 갖는 Flexible한 약한 음전하 물질은 Passive transport를 통해서 이동하기에 적합하며, 이보다 큰 크기를 갖거나 Rigid하고 양전하를 띠는 물질은 APC에 의해 탐식되어 Active transport에 의해서 주로 이동하게 된다. 림프관에 들어온 물질은 림프절로 도달하게 되며, 이때 70 kDa (5-8 nm) 이하의 물질은 Conduits 를 통해서 림프절 내부로 들어가게 되고 그 이상의 크기를 가진 물질은 림프절 내부로 들어가지 못하거나 Transcytosis 및 APC의 Propelling에 의해서 림프절 내부로 들어가게 된다 [22], [23].  

   이와 같은 물질 및 림프계의 특성을 고려하여 현재 전세계 수많은 연구팀들이 림프절 전달체 기반 면역치료제를 개발 중에 있다.

2.3. 최근 연구동향: Trojan horse 기반 림프절 약물 전달체

   기존 연구결과를 살펴보면, 림프관에 도달하기 위해서 필요한 크기(10-100 nm)와 림프절 내부로 관통하기 위한 크 기(5-8 nm)가 다르다는 크기 측면의 상충점이 존재한다. 즉, 5-8 nm의 물질은 림프절에 도달할 경우 림프절 내부로 전 달이 가능하지만, 그 자체가 이미 림프관에 진입하지 않고 혈액으로 순환하게 되므로 림프절 전달효율이 떨어진다. 반 면에, 10-100 nm 크기의 물질은 림프관 진입 및 림프절 도달은 효율적이지만 림프절 내부로는 잘 전달되지 못한다. 이 를 해결하기 위해, 조지아공과대학교의 Susan N. Thomas 및 M. G. Finn 그룹은 30 nm 크기를 가진 면역치료제를 함유 한 나노 입자가 림프절에 도달하면 5-8 nm의 면역치료제를 방출시켜 림프절 내부로 약물을 전달할 수 있는 Trojan horse 형식의 림프절 약물 전달체를 개발하였다 (그림 3). 이와 같은 Trojan horse 형식의 약물 전달체는 주로 2세대 항 암치료제에서 Solid tumor 내부 깊숙이 항암제를 전달하기 위한 목적으로, TME의 높은 Reactive Oxygen Species (ROS) 및 Redox conditions 또는 낮은 pH에 감응하는 화학 linker를 활용하여 오랜 기간 개발되어 왔다. 하지만 림프절의 SCS 에는 특별한 자극이 존재하지 않기 때문에, Trojan horse 형식의 림프절 약물 전달체 개발에는 기존에 활용되던 화학 감 응형 Linker의 사용이 불가능하다. 따라서 Susan N. Thomas 및 M. G. Finn 그룹은 외부의 다양한 자극에는 반응하지 않 고 오직 시간에 의해서만 First-order retro-Diels-Alder Fragmentation 방식으로 분해되는 Oxanobornadiene linker를 개발 및 활용하였다. Susan N. Thomas 및 M. G. Finn의 림프절 내부 약물 전달체의 전체적인 개발 방법은 다음과 같다. 림프 절로 효율적으로 도달되는 것으로 밝혀져 있는 Poly(propylene sulfide)로 안정화된 27 ± 0.6 nm 크기의 Pluronic micelle 을 준비하였다. Micelle의 외부에 Pyridyl disulfide를 개질화한 후 Thiol-reactive Oxanobornadien 결합을 이용하여 면역 치료제를 화학적으로 결합시켰다 (그림 3a). 이때 Oxanobornadiene의 종류에 따라 원하는 대로 반감기(Half-life)를 변경 할 수 있어 약물 전달체가 림프절 내에 도착한 이후에만 약물을 방출할 수 있도록 조절할 수 있었다. 개발된 약물 전달 체는 27 ± 0.6 nm의 크기를 가지지만 림프절에 도달하면서 Oxanobornadiene liker가 분해되므로 70 kDa이하의 면역치 료제를 방출하게 된다. 그 결과 SCS에서 림프절 내부로 약물을 효율적으로 전달할 수 있었고 (그림 3b), 이는 림프절 상 주 DC의 수뿐만 아니라 해당 세포에 전달되는 약물의 양 또한 증가시킬 수 있었다 [24], [25]. 

3. 결론

   본 기고문에서 3세대 항암치료제인 항암 면역치료제의 개발 및 활용에 있어 림프절의 구조와 기능, 림프절 약물 전 달의 중요성에 대해 살펴보았다. 뿐만 아니라 림프계의 물질 Transport에 대한 이해를 바탕으로 한 Trojan horse 형식의 림프절 약물 전달체를 개발에 관한 최근 연구 동향에 대해 소개하였다.

   림프절의 중요성은 항암 면역 치료에서뿐만 아니라 이미 mRNA vaccine을 통해 잘 알려져 있다. COVID-19 당시 대 부분의 사람들은 mRNA vaccine을 투여했고 림프절이 팽창되는 현상을 통해 적응 면역 반응과 항체 형성이 이루어지 는 것을 확인한 바 있다. COVID-19 mRNA 대신에 암 항원의 mRNA을 활용하여 이미 상용화된 COVID-19 mRNA vaccine을 항암 면역치료제로 개발하기기 위한 임상 3상이 진행되고 있는 것도 이미 잘 알려져 있다. 따라서 앞으로는 림프절 약물 전달체를 활용하여 항암 면역치료만이 아닌 다양한 질병을 치료할 수 있는 면역치료제가 개발될 것으로 기대된다.

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