1. 서론: 단백질 엔지니어링과 대사공학의 중요성 

   대사공학은 생명공학의 핵심 분야로, 미생물이나 다른 생명체의 대사 경로를 인위 적으로 조절하여 특정 화합물의 생산을 증가시키거나 새로운 생합성 경로를 개발하는 것을 목표로 한다. 또한 대사공학적 접근은 바이오 연료, 의약품, 화학물질 등 다양한 산업에서 요구되는 물질 생산을 위한 방법으로 각광받고 있다. 이 과정에서 선발된 효 소나 단백질이 효과적으로 작동해야 하며, 이러한 효소를 최적화하거나 새롭게 설계 하는 과정에서 단백질 엔지니어링을 필요로 하게 된다. 

   단백질 엔지니어링은 자연에 존재하는 단백질을 변형하거나 새로운 단백질을 설계 하여 원하는 기능을 가지도록 하는 기술이다. 그러나 이 과정에서 이용 가능한 단백질 의 다양성은 제한적이며, 이는 대사공학의 성공적 수행에 병목이 될 수 있다. 새로운 단백질을 발견하고 효율적으로 설계하기 위해 혁신적인 방법이 필요하며, 이 때 활용 할 수 있는 생물정보학 분석 방법들이 도움을 줄 수 있다. 서열 재구성 분석 방법인 ancestral sequence reconstruction (ASR)과 기능성 모듈 예측 기술 중 annotation-free discovery에 대해 살펴보고자 한다.

2. 본론 

2.1. Ancestral Sequence Reconstruction (ASR): 단백질의 진화적 재구성과 활용 

   Ancestral sequence reconstruction (ASR)은 현재 존재하는 유전자 서열을 분석하여 고대 생물체에서 유래한 단백질 서열을 재구성하는 분석 기술이다. 상동성을 가지는 유전자군을 분석하여 진화적으로 과거의 아미노산 배열을 추정할 수 있다는 ASR의 이론적 토대는 오래전에 정립되었다 [1]. 이 과정은 주로 현재의 유전 자 서열을 비교하고, 이를 바탕으로 진화적 계통수를 만들어 공통 조상의 단백질 서열을 추정하는 방식으로 이루어진다 (그림 1) [2]. 이렇게 재구성된 단백질은 현재의 단백질과 같은 특성을 갖는 다양성 집단을 제공하여, 효과적인 대사과 정 조절에 활용할 수 있다. 또한 현재의 단백질과는 다른 특성을 가질 수도 있으며, 이들은 대사공학에서 매우 유용하게 활용될 수 있다 [3]. 

   Ancestral sequence는 현재와는 다른 환경에서 존재하였을 것이기 때문에, 현대의 단백질과는 다른 안정성이나 기질 특이성을 가질 수 있다. 예를 들어, 고대 효소는 극한의 온도, pH, 염 농도 등과 같은 환경에서도 안정적으로 기능했을 가능성도 상정해 볼 수 있다. 이러한 특성은 현대 산업에서 요구되는 효소 설계에 활용될 수 있다. ASR을 통해 복원된 효소는 자연적으로 존재하는 효소보다 더 강력하고 다양한 기능을 가질 가능성이 있어, 이를 대사공학에 활용하면 산 업적 효율성을 크게 향상시킬 수도 있을 것이다. 오래전부터 열안정성 효소를 만들기 위한 노력이 이어져 왔는데, ASR 을 통한 성공 사례가 다수 보고된 바 있다 [4, 5]. 최근에는 효모(Saccharomyces cerevisiae)에서 ASR 분석을 통해 바이 오리파이너리에 활용할 13개의 새로운 xylose isomerase를 도입하여 높은 에탄올 농도(94.76 g/L)를 얻는데 성공하기도 하였다 [6].

   복수의 연구에서 ASR을 통해 복원된 고대 효소가 현대 효소보다 더 높은 촉매 효율을 보이거나, 현대의 단백질의 고 유한 기능을 복원할 수 있음을 보여주었다 [7]. 예를 들어, 항암제 글리벡(Gleevec)의 단백질 타겟에 대한 민감도 연구 결과는 ASR을 통해 구성한 ancestral protein으로부터 15개의 아미노산 치환이 Abl 인산화효소와의 특이적 결합을 이끌 어 낼 수 있음을 보여주었다. ASR을 통해 얻어진 serine protease는 분화된 네 가지 효소가 인지하는 곁사슬(side chain) 을 모두 인식할 수 있음이 보고되었으며, 이는 효소의 진화적 분화가 특정 기질을 배제하는 방향으로 진행될 수도 있음을 보여주었다 [7]. 식물에서는 CYP711 유전자군의 ASR 분석을 통해 11개의 공통 조상 단백질을 추론하였고, 육상 식 물에서의 식물호르몬 스트리고락톤(strigolactone)의 분화와 관련한 효소 반응의 다양성을 보여주었다 [8]. 이들 연구는 ASR이 새로운 생합성 경로를 개발하거나 기존 경로를 최적화하는 데 중요한 도구가 될 수 있음을 시사하였다.

2.2. 미생물 군집에서 기능성 모듈 예측 

   단백질 기능 예측에서 또 다른 중요한 혁신은 미생물 군집에서 기능성 모듈을 예측하는 "annotation-free discovery" 방법론이다. 전통적으로 단백질의 기능을 예측하기 위해서는 유전자 서열을 분석하고, 이 서열이 알려진 단백질이나 효 소와 얼마나 유사한지를 바탕으로 기능을 주석(annotation)하는 방식이 널리 활용되고 있다. 그러나 이러한 방식은 이미 알려진 정보에 의존하기 때문에 새로운 기능성 단백질이나 대사 경로를 발견하는 데 한계가 있으며, 알려진 단백질 도 메인이나 유사 단백질(orthologs) 자료가 희박한 경우 더욱 그러하다. 게다가 메타유전체 유래 데이터의 경우 미생물 계 통분류 조성이 표현형이나 목표 형질을 잘 반영하지 못한다 [9]. 

   Annotation-free discovery는 미생물 군집 내에서 유전자 서열 정보에 의존하지 않고 기능성 모듈을 탐색하는 방법이다. 이 기술은 복잡한 미생물 군집에서 기능적으로 연관된 유전자 집합을 직접적으로 식별하고, 그들의 생물학적 역할을 추론하는 데 활용된다(그림 2). 예를 들어, 특정 환경에서 수집된 미생물 군집의 유전자 데이터를 분석하여 아직 발견되지 않은 효소나 대사 경로를 찾을 수 있도록 도와준다. 이 방법의 중요한 장점은 미생물 군집의 복잡한 상호작용을 고려할 수 있다는 점이다. 미생물 군집은 종종 복잡한 대사 네트워크를 형성하며, 단일 유전자나 효소의 기능만으로는 설명할 수 없는 경우가 많은데, 복잡한 네트워크 내에서 중요한 기능성 모듈을 찾아내면 새로운 대사 경로를 개발하거나 기존 경로를 개선하는 데 큰 도움 이 될 수 있다. 최근 연구에 따르면, 미생물 군집 내 metabolic flux는 미생물의 계통분류학적 다양성보다 소수의 기능적 집단 (functional guilds)의 비율과 더 큰 상관관계를 갖는다고 한다. 이 방법론은 해양 마이크로바이옴의 질소 순환(nitrogen cycling) 과 관련된 두 개의 계통분류를 찾아내는데 활용되는 등 유용성이 입증되고 있다 [9].

2.3. ASR과 기능성 모듈 예측 방법론의 대사공학에서의 역할 

   앞서 설명한 ASR과 annotation-free discovery 기술은 대사공학 및 합성생물학에서 단백질 발굴 및 설계에 활용될 수 있는 가능성을 갖고 있다. 이러한 기술들은 효소의 안정성과 기능적 다양성을 탐색하고, 새로운 생합성 경로를 개발하 는 데 필수적인 역할을 할 수 있을 것으로 예상된다.

   먼저, ASR은 대사공학에서 사용되는 효소의 기능적 특성을 극대화하는 데 중요한 분석 방법론이 될 수 있다. 고대 서 열을 재구성하여 얻어진 효소는 현대 효소보다 더 높은 안정성과 효율성을 가질 수 있으며, 이를 통해 대사 경로의 효 율성을 크게 개선할 수 있을 것이다. 또한 대사 경로 재구성 과정에서 활용 가능한 효소들의 카탈로그를 제공하여, 대사 경로 조절 과정의 효율을 제고할 수 있을 것이다. 예를 들어, 고온에서 작동하는 효소가 필요한 경우, ASR을 통해 얻은 고대 효소가 좋은 대안이 될 수도 있기 때문이다.

   또한, annotation-free discovery 기술은 복잡한 미생물 군집 내에서 아직 밝혀지지 않은 기능성 모듈을 발굴하는 데 중 요한 역할을 할 것이다. 이 기술을 통해 새로운 대사 경로를 개발하거나, 새로운 대사 경로 모듈을 발굴하거나, 기존 경 로를 최적화할 수 있는 단백질을 탐색하는 데 활용할 수 있을 것이다. 이러한 접근법은 특히 합성생물학에서 새로운 생 합성 경로를 구축하는 데 필수적이며, 더 나아가 생물공학 전반에 걸쳐 활용될 수 있을 것으로 예상된다. 예를 들어, 고 대 효소를 현대 대사 경로에 재도입하거나, 미생물 군집에서 새롭게 발견된 기능성 모듈을 통합하여 새로운 생합성 경 로를 설계할 가능성을 생각해 볼 수 있다. 이러한 혁신적인 접근법은 산업적 생산 공정에서 더 높은 효율성과 안정성을 제공할 수 있으며, 이는 궁극적으로 대사공학의 응용 범위를 확장하는 데 기여할 수 있을 것이다. 

3. 결론

   대사공학과 합성생물학은 현대 생명공학의 중요한 분야로, 지속 가능한 바이오 생산 공정을 개발하는 데 중추적인 역할을 한다. ASR과 기능성 모듈 발굴 기술은 단백질 발굴 및 엔지니어링에서 새로운 가능성을 제시할 수 있어, 리소스 구축 및 개발 연구가 필요할 것이다. 고대 단백질의 재구성을 통해 새로운 기능과 안정성을 가진 효소를 개발을 기대할 수 있으며, annotation-free discovery 기법을 통해 미지의 기능성 모듈을 발견하여 대사공학에 응용할 수 있을 것이다. 이러한 기술들은 단순히 이론적 접근법에 머무르지 않고, 전술한 바와 같이 실제로 산업적 적용 가능성을 입증하고 있 다. 따라서 앞으로의 대사공학 연구에서 두 가지 기술을 적극적으로 활용하여, 효율적이고 혁신적인 생합성 경로를 구 축할 수 있을 것으로 보인다. 이는 나아가 지속 가능한 바이오 공정의 개발 및 산업 전반에 걸친 혁신을 이끌어 낼 수 있을 것으로 기대된다. 

참고문헌

[1] P. L. and Z. E. (1963) Chemical paleogenetics: Molecular “restoration studies” of extinct forms of life. Acta Chem. Scand. 17: S9-S16.

[2] L. O. Chisholm, K. N. Orlandi, S. R. Phillips, M. J. Shavlik and M. J. Harms (2024) Ancestral Reconstruction and the Evolution of Protein Energy Landscapes. Annu Rev Biophys. 53: 127-146.

[3] M. A. Spence, J. A. Kaczmarski, J. W. Saunders and C. J. Jackson (2021) Ancestral sequence reconstruction for protein engineers. Curr Opin Struct Biol. 69: 131-141.

[4] R. E. S. Thomson, S. E. Carrera-Pacheco and E. M. J. Gillam (2022) Engineering functional thermostable proteins using ancestral sequence reconstruction. J Biol Chem. 298: 102435.

[5] Y. Gumulya, J.-M. Baek, S.-J. Wun, R. E. S. Thomson, K. L. Harris, D. J. B. Hunter, J. B. Y. H. Behrendorff, J. Kulig, S. Zheng, X. Wu, B. Wu, J. E. Stok, J. J. De Voss, G. Schenk, U. Jurva, S. Andersson, E. M. Isin, M. Bodén, L. Guddat and E. M. J. Gillam (2018) Engineering highly functional thermostable proteins using ancestral sequence reconstruction. Nature Catalysis. 1: 878-888.

[6] S. Chen, Z. Xu, B. Ding, Y. Zhang, S. Liu, C. Cai, M. Li, B. E. Dale and M. Jin (2023) Big data mining, rational modification, and ancestral sequence reconstruction inferred multiple xylose isomerases for biorefinery. Sci Adv. 9: eadd8835.

[7] G. K. A. Hochberg and J. W. Thornton (2017) Reconstructing Ancient Proteins to Understand the Causes of Structure and Function. Annu Rev Biophys. 46: 247-269.

[8] M. H. Vinde, D. Cao, R. J. Chesterfield, K. Yoneyama, Y. Gumulya, R. E. S. Thomson, T. Matila, B. E. Ebert, C. A. Beveridge, C. E. Vickers and E. M. J. Gillam (2022) Ancestral sequence reconstruction of the CYP711 family reveals functional divergence in strigolactone biosynthetic enzymes associated with gene duplication events in monocot grasses. New Phytol. 235: 1900-1912.

[9] X. Shan, A. Goyal, R. Gregor and O. X. Cordero (2023) Annotation-free discovery of functional groups in microbial communities. Nat Ecol Evol. 7: 716-724.