1. 서론

   합성생물학은 공학 원리를 생물학에 적용하여 새로운 기능을 가지는 생물 시스템을 제작하는 학문이다1. 합성생물학은 화석 기반 제품을 대체하고 재생 가능한 생물 자원을 활용해 지속 가능한 바이오 경제를 발전시키는 데 핵심적인 역할을 할 것으로 기대된다2-4. 유전자 제작 기술은 합성 생물학의 설계, 구축, 테스트, 학습(DBTL) 연구 사이클에서 핵심적인 역할을 수행한다6. 합성생물학의 급속한 발전은 더욱 빠르고 정밀하며 비용 효율적인 유전자 합성 기술에 대한 높은 수요를 촉진하고 있다7.

   유전체를 설계하고 재구성하여 생물 시스템의 기능을 확장하거나 새로운 생명체를 개발하는 합성 유전체학은 유전자 합성 기술의 발전과 함께 2000대 이후 급속도로 발전하고 있다. 2002년에는 7.5 kb 소아마비 바이러스 유전체가 화학적으로 합성되었으며, 이는 최초로 바이러스 유전자를 합성한 사례로 주목받았다8. 이후, 2010년 Craig Venter 연구소는 최초로 자가복제 인공 박테리아인 Mycoplasma capricolum JCVI-syn1.0을 합성했다9. Sc 2.0 프로젝트는 6개 효모 염색체를 설계하고 화학적으로 합성하며 유전체 수준에서 유전자 조립 기술을 발전시켰다. 합성된 효모 균주는 야생형과 유사한 생리 활성을 보였고, 이는 대규모 합성 생물학 연구의 실현 가능성을 보여주었다10-15.

   유전자 제작(합성 및 조립)을 위한 전략은 크게 네 가지로 나뉜다. (1) 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성, (2) 짧은 이중가닥 유전자로의 조립, (3) 짧은 유전자 단편의 결합을 통해 긴 유전자를 생성, (4) 생체 내 재조합을 통한 20 kb 이상의 장쇄 유전자 조립이다6. 유전자 합성과 조립 과정은 반복적인 작업과 높은 정확도를 요구하며, 이를 간소화하고 효율성을 극대화하기 위해서는 자동화 기술의 도입이 필수적이다. 최신 자동화 플랫폼은 처리 시간을 단축하고 오류율을 줄여, 유전자 제작의 비용 효율성을 높이는 데 기여하고 있다. 본 기고에서는 합성생물학 연구를 지원하기 위해 개발되고 있는 고효율 유전자 합성 및 조립 기술에 대해 소개하고자 한다.

2. 합성생물학 유전자 합성/조립 기술의 발전

2.1. 올리고뉴클레오타이드 합성

2.1.1 칼럼 기반 합성

   칼럼 기반 유전자 합성은 고체 지지체에 뉴클레오타이드를 점진적으로 결합하는 방식으로, 높은 정확성과 대량 생산이 가능한 기술이다. 이 과정은 탈보호(deprotection), 결합(coupling), 캡핑(capping), 산화(oxidation)의 네 가지 화학 반응 단계로 이루어지며, 합성된 유전자는 암모니아나 알칼리 조건에서 고체 지지체로부터 분리된 이후 정제를 거쳐 완성된다16.

   1980년대 Applied Biosystems는 이러한 과정을 자동화한 최초의 유전자 합성기를 개발했으며, 현재 상용화된 BioAutomation의 MerMade 시리즈와 Biolytic의 Dr. Oligo 시리즈는 그 기술을 더욱 발전시켰다17. 예를 들어, MerMade 192R은 단일 실행으로 최대 192개의 올리고뉴클레오타이드를 합성할 수 있으며, 이를 통해 최대 6 kb의 유전자 조각을 생성할 수 있다. 그러나, 컬럼 기반 합성은 200 염기 이상의 서열 합성에서는 효율성이 감소하는 문제가 있으며, 이는 비용과 처리 시간에 영향을 미친다. 또한, 유기 용매 사용으로 인해 폐기물 관리가 복잡하여, 환경 친화적인 대안 개발이 요구된다6, 18.

2.1.2. 마이크로어레이 기반 합성

   마이크로어레이 기술은 실리콘 칩이나 유리 슬라이드 표면에서 유전자를 합성하는 고속 처리 기술로, 대량의 유전자 서열을 병렬적으로 합성할 수 있다18. 주요 기술에는 Photolithography, 잉크젯 프린팅, 전기화학 반응이 포함된다. Photolithography는 특정 위치에서 뉴클레오타이드를 결합하는 광활성화 화학 반응 기술이다19. Affymetrix는 최대 50만 개의 올리고뉴클레오타이드를 단일 칩에서 합성할 수 있는 시스템을 개발했다20. 잉크젯 프린팅은 유전자 염기를 칩에 직접 분사하여 올리고 뉴클레오타이드를 합성하는 방법이다. Agilent의 SurePrint가 대표적이며, 이는 최대 244,000개의 올리고뉴클레오타이드를 병렬로 합성할 수 있다21. 전기화학 기반 기술은 전기화학적 반응을 통해 보호기를 제거하고 합성을 진행하며22, CustomArray는 이를 통해 최대 8.4백만 개의 올리고뉴클레오타이드를 단일 칩에서 합성할 수 있다23.

2.1.3. 효소 기반 합성

   효소 기반 합성은 화학적 합성에 비해 온화한 반응 조건과 높은 정확성을 제공한다. Terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT)를 활용하여 ss유전자의 3′ 말단에 뉴클레오타이드를 첨가한다24, 25. 유전자 Script의 Syntax 시스템은 TdT와 가역적으로 종결된 뉴클레오타이드를 사용하여 280 bp 길이의 유전자를 99.7% 효율로 합성한다26. 2020년에는 효소 기반 유전자 프린터를 상용화하여 자동화된 고정밀 유전자 합성을 가능하게 했다6, 20.

3. 유전자 조립

   현재 De novo 유전자 합성의 길이는 제약을 받고 있기 때문에, 긴 유전자는 합성된 올리고뉴클레오타이드 조각을 조립하는 방식으로 제작된다6.

3.1 올리고뉴클레오타이드 조립 방법

   PCA(Polymerase Cycling Assembly)는 겹치는 서열을 가진 조각을 사용해 이중 가닥 유전자를 합성하는 PCR 기반 기술로27, 2003년 Craig Venter 연구팀은 이를 통해 phiX174 파지 게놈(5386 bp)을 단 14일 만에 조립한 바 있다28. LCR(Ligase Chain Reaction)은 PCA와 유사하지만 유전자 리가제를 활용하여 연결 과정을 간소화하는 방법이다29. OE-PCR과 Gibson 조립법은 각각 겹치는 서열을 기반으로 유전자를 합성하거나 플라스미드에 유전자를 조립하는 단일 단계 유전자 조립 방법이다30.

3.2 시험관 내 유전자 조각 조립 방법

   Restriction cloning은 가장 전통적인 유전자 조립 조각 조립 방법으로서, 특정 제한 효소를 사용하여 유전자 조각을 절단하고, 이 절단된 유전자 조각을 벡터에 삽입하여 새로운 유전자를 클로닝하는 방법이다. 이 과정에서 제한 효소는 특정 염기서열을 인식하여 유전자를 절단하며, 절단된 유전자 조각은 벡터의 동일한 제한 효소로 절단된 부분에 결합된다31.

그림 1. DNA 조립 방법의 모식도. A. Golden Gate 조립. B. Gibson 조립. C. 생체 내(in vivo) DNA 조립6

   Golden Gate Assembly는 2008년 Engler 연구팀에 의해 개발된 기술로, 기존의 Restriction cloning의 한계를 극복할 수 있는 효과적인 유전자 조립 방법이다. 이 기술은 IIS형 제한효소(type IIS restriction endonuclease)를 기반으로 한다. IIS형 효소는 일반적인 제한효소와 달리 인식 부위와 절단 부위가 다르며, 절단 부위가 임의로 조정될 수 있다. IIS형 효소는 cohesive end(접착성 말단)를 생성하여 여러 유전자 단편을 한 단계에서 매끄럽게 결합할 수 있도록 한다32 [그림 1A]. Gibson Assembly는 T5 엑소뉴클레아제(T5 exonuclease)의 5′ 엑소뉴클레아제 활성을 활용하여 유전자 단편을 절단한다. 그 후 Phusion 유전자 폴리머라제가 틈을 채우고, Taq 유전자 리가제가 닉(nick)을 복구한다. Gibson Assembly는 빠른 반응 시간, 간단한 조작, 높은 확장성, 최대 100 kb 길이의 더 긴 유전자 단편 조립 가능성과 같은 장점을 제공한다 [그림 1B]33.

3.3 생체 내 유전자 조각 조립 방법

   20 kb 이상의 긴 유전자 조각은 in vivo 시스템에서 더 효율적으로 조립된다. 대표적으로 효모 Saccharomyces cerevisiae는 유전자 단편을 흡수하고 재조합할 수 있는 능력을 가지고 있어 상동 재조합을 통해 유전자 단편을 효과적으로 조립할 수 있다34-36 [그림 1C]. 그 외에도, E. coli37, B. subtilis38, Physcomitrella patens39, Ralstonia, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Yersinia lipophilicity40 등의 미생물을 이용한 in vivo 조립 방법이 개발되었다.

4. 유전자 조립 자동화

4.1. 유전자 조립 자동화의 필요성

   생물공학은 방대한 설계 공간을 탐구하고 생물학적 복잡성을 해결하는 작업을 포함한다41. 예를 들어, 5개의 유전자가 구성된 대사 경로를 10개의 RBS로 구성된 조합 라이브러리를 만들기 위해서 100,000개의 가능한 조합이 생성될 수 있다42. 이러한 대규모 시행착오 기반 공학 실험은 합성생물학 분야에서 전통적인 노동 집약적 연구 방법으로는 해결하기 어려운 상당한 도전 과제를 수반한다. 따라서 고처리량(High-throughput) 유전공학 연구 플랫폼의 구축이 필수적이다6. 자동화 기술은 합성생물학 연구에서 유전자 조립 실험의 오류를 줄이고, 결과의 일관성과 재현성을 높이며, 대규모 조합 유전자 조립을 고처리량으로 수행할 수 있게 한다41.

4.2. 바이오파운드리에서의 유전자 조립

4.2.1. 바이오파운드리란?

   바이오파운드리의 명칭은 생물학의 ‘바이오’와 반도체 산업에서 반도체 위탁생산을 전담하는 ‘파운드리’를 합쳐 탄생한 단어이다. 바이오파운드리는 생물공학 연구를 위한 통합 자동화 실험실로, 유전자 설계, 유전자 조립, 테스트 및 데이터 학습 단계를 포함한 DBTL(설계-구축-테스트-학습) 주기를 자동화한다43. 이곳에서는 자동화된 로봇 장비와 고처리량 분석 도구를 활용하여 효율적으로 대규모 실험을 수행할 수 있다44. 바이오파운드리의 목적은 합성 생물학 제품과 생물 제조 공정 엔지니어링의 상용화와 지속 가능한 생물 경제와 개발 생물 경제로의 전환을 가속화하는 것이다45. 바이오파운드리는 자동화를 통해 합성생물학 연구 처리량을 비약적으로 상승시켰다. 예를 들어, 유전자 조립 자동화는 기존 대비 최대 20배의 효율을 제공하며44, 대규모 유전자 변형 작업을 하루에 수천 개까지 수행할 수 있게 되었다46. 이와 같은 처리량 증가는 생물공학 연구의 생산성을 크게 향상시켰다.

4.2.2. 바이오파운드리 내 유전자 조립의 자동화

   합성생물학 분야에서는 대규모 실험이 전통적인 수작업 방식으로는 한계가 있어, 이를 해결하기 위해 고처리량 엔지니어링 플랫폼과 자동화된 유전자 조립 기술이 개발되고 있다. 대표적인 바이오파운드리로는 iBioFAB, Codex DNA Gibson Assembly, Ginkgo Bioworks, Edinburgh Genome Foundry, London DNA Foundry, 그리고 대한민국 KRIBB Biofoundry Beta 등이 있다. 각 바이오파운드리에서 사용하는 자동화된 유전자 조립 기술은 다소 차이가 있지만, 일반적인 자동화 유전자 조립 프로세스는 아래 그림 2에 제시된 절차를 따른다6.

   iBioFAB은 2014년 Zhao Huimin 연구팀이 Golden Gate Assembly 방법의 원리를 기반으로 하는 고처리량 조립 플랫폼인 FairyTALE을 개발하며 시작되었다. 이 프로세스에는 플라스미드 구축, 로봇 조립, 동결 건조, Golden Gate Assembly 반응, 대장균 형질 전환, 다클론 배양 및 플라스미드 정제가 포함되어 있다47. 이후 연구팀은 합성 프로세스를 iBioFAB로 확장하여 유전자 생산 단가를 2배 이상 낮출 수 있었다48. 최근에는 연구팀이 개발한 PfAgo 기반 범용 유전자 조립 기술을 탑재한 PlasmidMaker 플랫폼을 통해, 효율적인 유전자 조립을 진행하고 있다49.

그림 2. 자동화된 유전자 조립 프로세스 개요 A. 고속 대량 균주 구축을 위한 워크플로. B. 바이오파운드리에서 유전자 단편을 조립하는 과정6

   Codex 유전자 Gibson Assembly는 2017년 Gibson 연구팀이 디지털-생물 변환기(DBC)를 개발하면서 시작되었다50. 이 시스템은 유전자 서열 정보를 입력하면 자동으로 유전자 합성과 조립이 이루어지며, BioXp™ 시스템 시리즈를 통해 고도화되었다. 특히, 2023년 출시된 BioXp™ 9600은 고처리량과 백신 및 생물제제 개발을 가속화했다6. 상업적 바이오파운드리인 Ginkgo Bioworks는 Foundry와 Codebase로 나뉘어 운영된다. Foundry는 자동화 로봇과 소프트웨어를 활용해 고처리량 미생물 제작과 데이터 분석을 수행하고, Codebase는 유전체 데이터 자산과 세포 프로그래밍을 지원한다. Ginkgo Bioworks는 자체 개발된 유전자 합성 및 고처리량 스크리닝 기능을 활용하여 3개월 이내에 유전자 설계부터 균주 활성 스크리닝 데이터 생성까지 수행할 수 있다6, 51.

   Edinburgh Genome Foundry(EGF)는 5 kb 이상의 대형 유전자 조립을 전문으로 하는 바이오파운드리이다. 에든버러 바이오파운드리는 3개의 자율 로봇 암을 이용해 합성생물학 연구를 수행한다6, 44. 특히, EGF는 시퀀스 조각, 클로닝 시뮬레이션, 골든 게이트 오버행 설계, 유전자 은행 기능 전송 등을 포함하여 대형 유전자 단편 및 조합 유전자 라이브러리의 설계 및 구축을 위한 20개 이상의 산업용 소프트웨어 패키지를 개발하여 공유했다51. EGF 플랫폼은 Golden Gate, Gibson Assembly, 효모 재조합 등 다양한 기술을 지원하며, Genetic Constructor와 같은 도구를 통해 대형 유전자 조립과 라이브러리 제작을 간소화했다52.

   Joint BioEnergy Institute의 연구진들은 바이오파운드리 내 연구의 설계를 돕는 j5 CAD 소프트웨어를 개발했다. J5 CAD는 SLIC, Gibson, CPEC, Golden Gate 같은 다중 파트 유전자 조립을 자동화하여 유전자 조립의 시간과 비용을 절감 할 수 있다53. London DNA Foundry는 OpenTrons Liquid handler 플랫폼 기반의 Biopart Assembly Standard for Idempotent Cloning(BASIC)을 개발해 여러 조각의 유전자의 고처리량 조립을 지원한다. 한 번에 88개의 플라스미드를 성공적으로 구축한 바 있다54.

그림 3. 2024년 10월 한국에서 개최된 GBA. GBA 회원들의 KRIBB Biofoundry Beta 방문 기념 사진

   글로벌 바이오파운드리 연합(Global Biofoundry Alliance, GBA)은 2019년에 설립된 국제 바이오파운드리 협력 네트워크로, 비상업적 바이오파운드리 간의 협력을 촉진하는 것을 목표로 한다. GBA는 공유 인프라, 표준화된 프로토콜, 그리고 협력 연구 사례를 통해 합성생물학 연구의 효율성을 제고하고 있다. 또한, UN 지속가능개발목표와 같은 글로벌 도전 과제 해결을 위해 협력 프로젝트를 추진하며, 합성생물학 연구와 바이오디자인 분야의 국제적 협력을 강화하고 있다44[그림 3]

그림 4. (좌) 생명연에서 운영되고 있는 KRIBB Biofoundry Beta, (우) 구축될 예정인 국가 바이오파운드리

   자동화된 유전자 합성과 조립 기술은 합성생물학 연구의 효율성과 정확성, 생산성을 크게 향상시켰다. 이 기술은 미래 생명과학 연구와 산업 발전의 핵심이 될 것이다.

5. KRIBB Biofoundry Beta

   한국생명공학연구원에 위치한 KRIBB Biofoundry Beta에서는 PCA, Gibson Assembly, Golden Gate Assembly, in vivo recombination 등 기존의 유전자 조립 기술뿐만 아니라, 자체적으로 개발한 고효율 모듈화 유전자 조립 기술을 활용하여 합성 생물학 연구 고도화에 필수인 고처리량 유전자 조립을 수행하고 있다. 또한, DNA 조립, 변이 생성, 유전체 설계, DNA 부품 저장, 장비 모니터링 및 예약 등 바이오파운드리 연구를 위해 필요한 다양한 기능을 지원하는 소프트웨어를 자체적으로 개발하여 연구의 효율성을 극대화하고 있다. 또한 인공지능 모형을 개발 및 활용하여 고처리량 연구를 통해 얻은 데이터의 기계 학습 연구도 진행하고 있다. 이러한 기술들을 기반으로 KRIBB Biofoundry Beta는 자동화 시스템을 이용해 목적 물질을 고효율로 생산하는 세포 공장의 구축을 1차 목표로 삼고 있다5.

   KRIBB Biofoundry Beta는 국가 바이오파운드리의 ‘베타 테스트’를 진행하며 핵심 기술을 조기 확보 중인 시설이다. 지난 해 ‘바이오파운드리 인프라 및 활용기반 구축 사업’이 예비타당성 조사를 통과했으며, 이를 기반으로 2025년부터 5년간 총 1,263억 원 규모의 국가 바이오파운드리가 구축된다. 생명연 부지에 바이오파운드리 전용 센터 건립을 시작으로, 바이오파운드리를 효율적으로 운영하기 위한 통합 플랫폼이 2029년까지 완성될 계획이다[그림 4]. 국가 바이오파운드리는 국내 합성생물학 분야의 산·학·연 연구자들에게 다양한 지원 서비스를 제공하여 연구 개발을 가속화하고, 이를 통해 국가 합성생물학 기술의 경쟁력을 확보에 기여할 것이다.

결론

   자동화된 유전자 합성 및 조립 기술은 합성생물학 연구의 효율성과 생산성을 획기적으로 향상시키며, 지속 가능한 바이오경제 실현에 핵심적인 역할을 하고 있다. 바이오파운드리는 이러한 기술들을 통합적으로 운영하는 자동화 연구 플랫폼으로, 설계-구축-테스트-학습(DBTL) 주기를 반복하며 연구 생산성을 극대화한다. KRIBB Biofoundry Beta는 고처리량 세포 공장 구축 기술을 선도하며, 국가 바이오파운드리의 성공적인 운영을 위한 기반을 마련하고 있다. 앞으로 국가 바이오파운드리는 국내 합성생물학 연구의 경쟁력을 강화하고 글로벌 도전 과제 해결에 기여할 것으로 기대된다.

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