1. 서론

   2024년 노벨 생리의학상 수상자는 마이크로RNA(miRNA)를 최초로 발견한 Victor Ambros 교수와 Gary Ruvkun 교수로 선정되었다. miRNA는 일반적으로 20-25개 길이의 염기서열로 구성되어 있는 짧은 non-coding RNA로, 1994년 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)에서 처음으로 각종 유전자의 발현을 제어하는 역할이 밝혀졌다 [1]. miRNA는 자신에 상보적인 염기 서열을 가지는 전령 RNA(mRNA)에 결합하여 mRNA의 분해를 유도하거나 단백질로의 번역 과정을 저해하는 방식으로 해당 유전자의 발현을 억제한다(그림 1) [2,3]. 현재까지 인체 내에서만 2000종 이상의 miRNA가 발견되어 있으며 [4], 세포의 생식과 분화, 각종 대사 과정, 항상성의 유지 등 사실상 모든 생명 활동의 제어에 관여하고 있다는 것이 알려졌다 [5,6]. miRNA들의 이상 발현은 각종 질병의 발생에 연관된 다양한 생물학적 경로들에 대한 정보를 제공하며, 따라서 많은 연구자들이 이러한 miRNA를 각종 질병에 대한 진단을 수행하기 위한 새로운 바이오마커에 주목하고 있다. 본 기고문에서는 miRNA를 통한 질병 진단 기술의 최신 동향에 대해 살펴보고자 한다.

2. 본론

2.1 각종 질병의 바이오마커로써의 miRNA

   2005년 George Calin 교수의 연구팀이 만성 림프구성 백혈병에서 miR-15a와 miR-16-1의 저발현이 암세포의 자멸(apoptosis)을 억제한다는 것을 발견한 이후로 [7] miRNA와 질병의 관계에 대한 연구는 최근 20년 사이 매우 빠른 속도로 이루어지고 있다. 각각의 miRNA의 기능에 대한 연구가 진행됨에 따라 miRNA의 발현 패턴을 통해 질병의 조기 진단, 아형 분류, 예후 예측 및 추적을 수행할 수 있게 되었으며, 이에 따라 향후 환자에 대한 맞춤형 진단에 응용할 수 있을 것으로 많은 연구자들이 전망하고 있다 [8].

   miRNA의 발현 이상과 연관된 질병들 중 가장 많은 연구가 진행된 질환이 각종 암으로, miRNA의 종류에 따라서 암의 진행을 억제하거나 촉진하는 역할을 수행하는 것이 밝혀져 있다 . 가장 대표적인 예시가miR-21로, phosphatase and tensin homolog(PTEN), programmed cell death protein 4(PDCD4)와 같은 암 억제 유전자들의 발현을 저해하여 뇌종양, 간암, 폐암, 난소암, 백혈병 등 각종 암세포의 생장을 돕는 종양 유발 miRNA(oncomiR)로 알려져 있다 [9]. 반대로 miR-16-1의 경우 B-cell lymphoma-2(BCL2), microtubule associated protein7(MAP7) 등 종양을 유발하는 유전자들을 억제하는 기능을 하며, 이에 백혈병, 전립선암, 폐암 등의 암에서는 miR-16-1의 저발현이 발견된다 [10]. 이러한 miRNA들은 대부분의 암에서 동일한 역할을 하지만, miR-29의 경우에는 유방암에서는 종양 성장과 전이를 촉진하는 역할을 하는 반면 [11], 폐암에서는 종양의 침윤과 전이를 억제한다 [12]. 이렇듯 암의 종류에 따라 각종 miRNA들이 발현되는 양이 서로 달라지며, 이러한 miRNA들을 다중 정량하여 각각의 암 환자의 분자적 아형, 약물 및 방사선 치료에 대한 저항성, 전이 위험성 등에 대한 예측을 수행할 수 있다 [13].

그림 1. miRNA의 생성과 유전자 제어 과정에 관한 모식도 [3]

   최근에는 miRNA와 심혈관계 질환의 상관관계 또한 많은 연구가 진행되고 있다. 심장 근육 세포의 손상으로 발생하는 Troponin, Creatine kinase-MB (CK-MB) 등은 심혈관계 질환의 단백질 바이오마커들로 심혈관계 질환 진단 지표로 활용되었으나, 일반적으로 이들의 수치는 증상이 발현된 후에야 순환계에 방출되기 때문에 조기 진단에 활용하기는 어려웠다. 이에 반해, miRNA는 심혈관계 질환의 증상이 발생하기 이전 단계에서부터 발현 패턴의 변화가 시작되어, 심혈관계 질환의 조기 진단에 유용할 뿐만 아니라 [14], 콜레스테롤 대사 [15], 염증 반응 [16], 동맥 평활근세포의 생장 [17] 등에 관여한다는 연구 결과가 발표되어 있다. 대표적으로 miR-221/222 클러스터의 과발현은 동맥 평활근세포의 과도한 생장을 유도하여 죽상동맥경화증 (artherosclerosis)의 원인이 되며 [18], miR-1은 심장 박동과 연관된 각종 이온 채널들의 발현을 제어하여 과발현 또는 저발현 시 모두 심근경색을 유발한다 [19]. 많은 심혈관계 질환은 치명적인 증상이 매우 급격하게 나타나기 때문에, 심혈관계 질환의 발생 기작에 관련된 miRNA들을 통해 질환의 조기 진단 및 예측을 수행함으로써 환자의 생존율을 크게 높일 수 있을 것으로 예상한다.

   이외에도, miRNA를 활용해 난치성 질환 중 하나인 치매를 조기 진단하거나 치료할 수 있는 실마리가 발견되어 주목 받고 있다. 치매는 여러 가지 원인으로 신경 세포가 손상되면서 발생하는 퇴행성 질환으로, miRNA들은 신경 세포의 단백질 발현과 향상성 유지에 관여하여 이러한 치매의 발생을 억제 또는 촉진한다 [20]. 가장 대표적인 예로 miR-20a, miR-17-5p, miR-106b로 이루어진 miR-20a 군(family)은 알츠하이머성 치매를 유발하는 아밀로이드 베타의 전구체 발현을 억제하는 것으로 알려졌다 [21]. 파킨슨성 치매의 경우, miR-30a-5p가 도파민 작동성 신경 세포(dopaminergic neuron)의 brain-derived neurotrophic factor(BDNF) 발현을 억제하여 신경독성을 유발하는 것이 발견되었다 [22]. 또한 miR-501-3p, miR-92a 등과 같은 miRNA들은 시냅스에 발현되는 칼슘 (Ca) 이온 채널의 일종인 N-methyl-Daspartate (NMDA) receptor 발현에 관여하여 시냅스 가소성을 제어함으로써 치매의 발생을 억제한다 [23].

2.2 miRNA를 이용한 질병의 진단 기술

   miRNA들의 발현은 각종 질병의 발병 및 진행과 연관되어 있어 환자 맞춤형 진단을 수행하기 위한 바이오마커로 그 중요성이 매우 높지만, 길이가 짧고, 체내에 극소량으로 존재하며, 단일 염기 차이와 같은 유사성이 매우 높은 miRNA family들이 다수 존재하기 때문에 검지가 어렵다는 점에서 임상적으로 진단 과정에 활용하는데 어려움이 있다. 특히 현재까지는 miRNA 정량검사에 Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction(qRT-PCR)이 표준방법으로 사용되고 있으나, 이 기술은 프라이머의 설계에 따른 증폭 효율의 문제, 정량 데이터의 표준화를 위한 internal control의 선정 문제와 함께 긴 시간 소요, 부정확한 증폭으로 인한 낮은 정확도 등 해결해야 할 여러 문제를 가지고 있다 [24]. 이러한 문제점을 해결하기 위해서 현재까지 새로운 여러 가지 miRNA 검출 센서와 이를 활용한 진단 기술이 개발되어 왔으며, 이 단락에서는 miRNA 검지를 위한 대표적인 최근 센서 연구들을 소개하고자 한다.

2.2.1 전기화학 센서를 이용한 miRNA 검지 방법

   전기화학 센서는 전해질의 miRNA가 전극에 결합함에 따라 전극과 전해질 사이의 전자 전달 효율이 변화하며, 이로 인해 발생하는 산화환원 반응의 양론적, 속도론적 변화를 전류, 전압, 임피던스 등의 전기 신호로 읽어냄으로써, 타겟 miRNA를 검지한다. 전기화학 센서는 구성이 간단하고 시간 소요가 매우 적으며 민감하다는 장점을 가지고 있어 miRNA의 검지를 위한 센서로 현재 많이 활용되고 있다 [25].

   miRNA 검지를 위한 전기화학 센서의 개발은 일반적으로 새로운 전극 구조의 개발, miRNA 타겟을 검출하기 위한 receptor의 개량, 전해질에서 2차적인 신호 증폭을 수행하기 위한 새로운 화학 반응의 도입 등이 이루어지고 있다. 이러한 miRNA 검지용 신규 센서 개발의 한 예시로 Arduini 교수의 연구팀은 췌장암의 주요 바이오마커로 지목되고 있는 miR-492에 대한 검지를 수행할 수 있는 전기화학 센서를 개발하였다(그림 2a) [26]. 의료 현장에서의 활용성을 높이기 위해서 해당 연구에서는 간단하고 저비용으로 제작 가능한 종이 기반의 전극 구조를 새로 개발하였고, miRNA에 대한 검지 정확도를 높이기 위해 receptor로 기존에 이용되었던 DNA 프로브 대신 peptide nucleic acid(PNA)를 프로브로 사용하였다. PNA는 DNA의 당-인산 골격 구조가 폴리펩티드로 대체된 인공 핵산으로, DNA와 다르게 골격 구조에 자체적인 전하가 없어 타겟 RNA와 더 높은 강도로 결합할 수 있어, 복잡한 조성의 시료에서도 별도의 전처리 없이 miRNA를 검지할 수 있었다. 해당 연구에서는 miR-492를 혈액 샘플 내에서 6 nM 수준으로 검지할 수 있었다. 전기화학 센서 개발에 관한 다른 연구로는 Chen et al.의 전기촉매(electrocatalyst)를 사용하는 전기화학 센서가 있다(그림 2b) [27]. 해당 센서는 methylene blue(MB)로 표지된 DNA 프로브를 사용하였으며, MB가 전해질인 [Fe(CN)6]3-의 환원을 촉진하는 촉매의 역할을 한다. miRNA는 전극 표면에 MB 표지된 DNA 프로브와 경쟁적으로 결합하며, 이에 따라 miRNA의 농도가 높을수록 전기 신호가 감소한다. 이러한 방식으로 해당 연구에서는 45 aM 농도의 miR-21을 검지할 수 있었으며, 이를 통해 유방암 환자와 정상인을 정확하게 구분할 수 있었다.

2.2.2 Fluorescence resonance energy transfer(FRET)를 이용한 miRNA 검지

   FRET 현상은 두 종류 이상의 형광 물질이 서로 근접해 있을 때 한쪽의 형광 물질(공여체)이 받은 에너지가 공명을 통해 다른 쪽의 형광 물질(수여체)로 전달되어 형광을 발생시키는 현상이다 [28]. FRET 현상은 공여체와 수여체의 거리에 따라 매우 민감하게 변화하는 특성을 가지고 있으며, 일반적으로 miRNA와 프로브 간의 결합 과정에서 동반되는 프로브의 구조적인 변화가 발생하게 되고, 이로 인해, 발생하는 FRET 현상은 형광 신호의 세기를 변화시켜 miRNA 검출 과정에서 활용할 수 있다.

그림 2. a) PNA 프로브를 이용한 종이 전극 기반 miRNA 검지 센서 [26], b) MB를 전기 촉매로 활용한 miRNA 검지 전기화학 센서의 작동 [27]

   이러한 방식의 대표적인 예시로, Afzalinia와 Mirzaee 연구팀은 miRNA가 두 개의 프로브와 sandwich hybridization을 이루어 FRET 현상 기반의 miRNA 검지 방법을 개발하였다(그림 3a) [29]. 해당 연구에서는 형광 물질이자 에너지 공여체로 란타넘(La(III)) 기반의 Metal–organic framework(MOF)를 사용하고, 수여체로는 은 나노입자를 채택하였다. MOF는 금속 원자 또는 이온들이 유기 분자들을 통해 연결되어 있는 구조체로, 이들 중 란타넘족(lanthanide) 금속 이온을 중심으로 한 형광 MOF는 주변 유기 분자들과의 상호작용을 통해 매우 정교하게 형광 특성을 나타낼 수 있어 최근 형광 기반 센서 연구에서 주목을 받고 있다. 여기에서는 DNA 프로브가 고정된 La(III)-MOF와 은 나노입자가 타겟 miRNA와 sandwich hybridization 형태로 miRNA에 결합함에 따라 서로 간의 거리가 가까워지게 되며, 이에 따라 La(III)-MOF가 형광 신호를 내지 않는 은 나노입자에 에너지를 전달하게 되어 형광 신호가 약해진다. 해당 연구에서는 이러한 방식으로 폐암의 바이오마커인 miR-155를 5.5 fM의 검지 한계로 검출할 수 있었다. 다른 예시로, Kemin Wang 교수 연구진은 타겟 miRNA가 존재할 때 연쇄적인 strand displacement 반응을 통해 형광 신호가 크게 증폭되는 FRET nanoflare 기반의 miRNA 검지 시스템을 개발하였다(그림 3b) [30]. FRET nanoflare는 하나의 금 나노입자에 형광 공여체와 수여체가 동시에 결합한 프로브 DNA와, 연쇄적인 strand displacement 반응을 유발할 수 있는 recognition DNA가 고정되어 있는 형태로 센서를 구성하였다. 타겟 miRNA가 없는 상태에서 형광 수여체는 상대적으로 거리가 가까운 금 나노입자에 에너지를 전달하여 형광을 내지 않으며, 수여체와의 거리가 멀어 FRET으로 인해 에너지를 잃지 않는 공여체의 형광 신호만이 발생한다. 타겟 miRNA와 함께 해당 센서에서 연쇄 반응을 유발할 수 있는 “fuel” RNA를 첨가하면 프로브 DNA가 동시에 금 나노입자에서 분리되면서 hairpin 구조를 형성하여 프로브의 양 끝에 위치한 두 형광 물질 간의 FRET이 일어나고, 이로 인해 크게 증폭된 수여체의 형광 신호를 측정하여 miRNA를 검지하였으며, 이 FRET nanoflare는 암세포 내에서 let-7a를 9 pM의 검지 한계로 측정할 수 있었으며, 형광 이미징을 통해 in vivo에서 let-7a의 분포를 관찰할 수 있었다.

2.2.3 Localized surface plasmon resonance(LSPR) 센서 기반의 miRNA 검지

   LSPR 현상은 금, 은 등의 귀금속 나노입자 상에 특정 파장의 빛을 조사했을 때 나노입자의 표면에 있는 자유 전자들이 집단적으로 공명하여 빛을 강하게 산란하는 현상으로, 나노입자들이 bulk 상태의 금속과 구분되는 광학 특성을 가지도록 하는 원인이다. 이러한 LSPR 현상은 입자의 형태와 입자 주변의 굴절률 변화에 매우 민감하게 반응하며, LSPR 센서는 일반적으로 타겟 바이오마커로 인한 입자 주변의 굴절률 변화를 LSPR 스펙트럼 측정을 통해 검지한다 [31]. LSPR 센서는 단일 분자와 비슷한 크기를 갖는 개별 나노입자를 초소형의 나노센서로 활용하기 때문에, 별도의 신호 증폭 과정이 없이 단일 분자 단위의 초고민감도의 검지가 가능하다는 장점이 있다.

그림 3. a) La(III)-MOF와 은 나노입자를 이용한 FRET 기반의 miRNA 검지 방법 [29], b) miRNA와 반응하여 연쇄적인 strand displacement를 일으키는 FRET nanoflare 구조 [30]

   입자의 LSPR 특성은 입자의 형상과 조성에 따라서도 크게 달라지기 때문에, 플라즈모닉 센서의 개발은 일반적으로 우수한 LSPR 특성을 가지는 새로운 금속 나노소재의 개발을 위주로 이루어지고 있다. 대표적으로 Sim 연구팀은 DNA를 기반으로 한 삼합체 형태의 독특한 나노구조인 DNA-assembled advanced plasmonic architecture(DAPA)를 개발하여 miRNA의 검지를 수행하였다(그림 4a) [32]. DAPA 구조는 금 입자들 사이를 잇는 DNA 이중나선 구조에서 pH 조절을 통해 당-인산 골격 구조의 전하를 조절하여 금 이온이 DNA 이중나선 가닥을 따라 환원되게 하는 방식으로 합성되었다. DAPA 구조에서는 DNA로 인해 형성된 입자 사이의 bridge와 gap 구조에서 국소적으로 전자기장이 집중되는 hot spot이 형성되어, 매우 강한 LSPR 특성을 보인다. 해당 연구는 DAPA 구조를 매우 높은 민감도를 가지는 나노센서로 활용하여 알츠하이머 질환에 연관된 3종류의 miRNA(miR-125b, miR-15a, miR-361)를 각각 10 aM 수준의 검지 한계로 검지하여 알츠하이머 환자를 정상인으로부터 정확하게 구분할 수 있음을 보여주었다. 또한 Sardar 그룹에서는 삼각형의 금나노프리즘(AuTNP) 구조를 일반적인 384 well plate에 고정하여 다수의 miRNA들을 측정가능한 LSPR 센서를 개발하였다(그림 4b) [33]. 기존의 LSPR 센서는 일반적으로 slide glass 상에 입자를 고정하는 방식으로, 다수의 miRNA를 검지하는 센서를 구성하기에는 어려운 방식이었는데, 해당 연구에서는 PCR 등에서 사용하는 384 well plate를 이용하여 여러 종류의 miRNA를 동시에 검지하고, 췌장암 특이적인 miR-10b와 let-7a에 대해 약 85 pM 수준의 민감도로 검지를 수행할 수 있었다.

2.2.4. Surface enhanced Raman scattering(SERS)를 이용한 miRNA 검지

   SERS 현상은 금속 나노소재의 LSPR 효과에서 유발된 현상으로, 나노소재의 주변에 분자가 위치할 때 분자의 진동 운동으로 인해서 발생하는 빛의 비탄성 산란인 라만 산란광이 나노소재의 LSPR로 인해 크게 증폭되는 현상이다. 일반적으로 분자의 라만 산란 신호는 분자의 고유한 화학 결합 특성을 반영하고 있어 높은 특이도를 가지는 반면 신호가 매우 미약하여 검지가 어려우나, 금속 나노소재로 인한 SERS 현상은 라만 산란을 약 108배 이상 크게 증폭시킬 수 있어 각종 분자에 대한 비표지 검지를 가능하게 한다 [34].

   SERS 현상은 특히 나노입자들의 모서리 또는 꼭지점 구조, 입자 사이의 gap 등 특정한 나노미터 크기의 형태에서 매우 크게 나타나는 것이 알려져 있으며, 이에 따라 일반적인 연구에서는 이러한 hot-spot을 많이 형성하는 나노소재를 개발하는 것을 목표로 한다. 예를 들어, Lee et al.은 다수의 hot-spot을 형성하기 위해 head-flocked 나노기판을 제작하고 이를 miRNA 검지를 위한 SERS 센서로 응용하였다(그림 5a) [35]. Head-flocked 나노기판은 flexible한 실리콘 나노기둥 구조 상에 금 증착을 통해 제작하였으며, DNA 프로브를 결합시키는 incubation 과정에서 wetting되었을 때 실리콘 나노기둥이 모세관 힘을 통해 서로 모이면서 금으로 이루어진 head 구조가 밀착된 hot-spot을 형성하게 된다. 이러한 특성을 이용한 head-flocked 나노기판 기반의 SERS 센서는 유방암에 연관된 miR-21, miR-200c, miR-222를 각각 1 aM 수준의 검지 한계로 검지하였고, miRNA들의 발현 패턴을 분석하여 맞춤형 치료 접근을 위한 유방암의 분자 아형을 분류할 수 있음을 보고한 바 있다. 이외에도 Feng의 연구팀은 SERS 기술에 catalytic hairpin assembly(CHA) 기술을 접목하여 2차적인 신호 증폭 기술을 개발을 통해 miRNA의 검지를 효율적으로 수행할 수 있는 SERS 센서를 개발하였다(그림 5b) [36]. CHA는 DNA hairpin들 간의 상보적인 결합을 통해 중합 효소 없이 DNA를 증폭하는 등온 증폭 기술로, 해당 연구에서는 라만 신호를 발생시키는 reporter로 MB가 결합한 DNA hairpin 구조와 SERS 효과를 내는 금-은 coreshell 나노입자를 이용하여 센서를 구성하였다. 타겟 miRNA는 DNA hairpin과 결합하여 연쇄적인 DNA 혼성화를 유발하며, 혼성화된 DNA 구조는 나노입자와 결합하여 MB의 SERS 신호를 발생시킨다. 해당 연구에서는 지중해 빈혈증(thalassemia)의 발생에 연관된 miR-210을 5 fM의 민감도로 검지할 수 있었다.

3. 결론

   miRNA와 생체 내 각종 생물학적 경로의 상관관계에 대한 연구는 매우 빠른 속도로 진척되고 있으며, 특히 최근의 오믹스 기술의 발전은 이러한 연구를 크게 가속시키고 있다. 이에 따라 miRNA 발현 패턴을 통해 질병의 다양한 양상에 대한 매우 복잡한 정보를 얻어내는 것이 가능해졌다. 앞서 언급하였던 miRNA 검지의 많은 난관을 극복하기 위한 다양한 시도들이 이루어지고 있으며, FRET 기반 기술과 같은 일부 기술은 실제로 진단에 응용 가능한 실용화 단계에까지 도달하였다. 이러한 miRNA 검지 기술을 통해 궁극적으로는 질병의 진단뿐만 아니라 환자 개인의 질병 특성을 분류, 예측하여 환자 맞춤형 의료 서비스를 제공할 수 있는 맞춤 의학이 실현될 것으로 전망한다.

그림 4. a) DAPA 구조의 합성과 이를 이용한 miRNA의 검출 방법 [32], b) 384 well plate 형식으로 제작된 AuTNP 입자 기반의 miRNA 검출 센서 [33]

그림 5. a) Head-flocked 나노기판을 이용한 SERS 기반 miRNA 검출 센서 [35], b) CHA 연쇄 혼성화 반응을 통해 SERS 신호를 증강한 miRNA 검출 기술 [36]

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