액체 생검의 암 질환 특이적인 짧은 염기서열 miRNA 분석 진단
Date 2017-10-09 15:42:01 페이스북으로 보내기 트위터로 보내기 hit 1,939
엄 숭 호
교수
성균관대학교 화학공학부
sh.um@skku.edu

1. 액체 생검의 도입 및 질환 특이적 바이오마커


암을 진단하기 위해서 전산화 단층촬영(CT), 자기공명 영상촬영(MRI), 양전자 방출단층촬영(PET)과 같은 고비용의 검사를 받는 것이 일반적으로 보편화되어 있다[1,2]. 그러한 검사를 통하여 대상 암을 확진하는 것은 쉽지 않아서 추가적인 조직검사가 절실히 필요로 된다. 흔히, 종양의 악성과 양성을 구분하기 위해 병변에서 채취된 조직을 현미경으로 관찰한다. 조직 일부분을 수술적으로 채취해내는 과정에서 환자가 극심한 두려움과 고통을 느끼게 되고, 감염된 암의 정보를 확실히 알아 내는 것은 쉽지않다. 암은 유전적 다양성이 크기 때문에 조직의 위치에 따라서 생물학적 표현 양상이 다를 수 있다[3]. 이 때문에 채취한 일부분의 조직에서 얻어지는 정보를 통해서 일방적으로 치료 방식을 확정하는 것은 한없는 불확실성이 존재한다. 이를 극복하고자 횟수를 늘려 조직을 지속적으로 채취하기도 어렵다. 또한, 암의 성장과 더불어 변하는 실시간 정보를 일정하게 얻어내기는 더더욱 힘들다. 환자에 따라서 암의 발생 위치나 현 상태 및 관련 치료방법 등의 문제로 조직검사가 불가능한 경우도 빈번히 있다[4,5].
정확한 암 진단을 위한 조직검사의 단점들을 극복하기 위한 현명한 방안으로 혈액 샘플 기반의 액체 생검(liquid biopsy) 분자진단 방식이 점차 도입되고 있다. 채취된 혈액 샘플에는 생체 내 다양한 세포군들로부터 기인한 바이오 분자들이 존재하게 된다[6]. 암세포 또한 특이적인 분자들을 혈액 속으로 내보내기도 하고 암세포 자체가 붕괴된 후 세포 부스러기 자체가 혈액 속을 떠다니기도 한다. 혈액 내 이러한 암세포 유래 물질을 분석하고 추적하면 비 침습적인 방식을 통하여 암 진단이 가능해질 수 있다. 이는 환자들의 편리성을 개선함과 동시에 비용적 측면에서도 단층촬영이나 조직검사보다 더 유리하다.
암 환자의 혈액에 특정 단일 가닥 염기서열이 더 많이 존재한다는 것은 바이오마커시장이 확립되어 현재와 같은 규모로 커지기 전에 이미 밝혀져 있었고[7], 병적 상태와 정상 상태를 구분할 수 있는 높은 유의성을 갖는 바이오마커를 발굴하면서 실제 임상에 적용하려는 노력이 지속되고 있다. 바이오마커에는 핵산 기반 바이오마커와 단백질 기반 바이오마커 이외에도 지방질, 대사물질 등이 포함되며, 단순히 병을 진단할 뿐 아니라 병이 진행되는 단계를 보여주기도 한다. 특정 약물에 대한 약효나 부작용 등을 알려주며 다양한 활용성이 각광받고 있다[8]. 새로운 암 치료제가 지속적으로 개발되고 있음에도 불구하고 암질환으로 사망하는 환자 수는 끊임없이 증가하고 있기 때문에 바이오마커를 효과적으로 모니터링하는 방법의 중요성은 더더욱 강조되고 있다. 특히, 2003년 4월 인간 게놈 프로젝트가 완성된 후, 단백질보다 안정성이 뛰어나고 이용이 편리한 유전체 기반의 바이오마커에 대해서 생체 내에서 직접 실시간으로 분석하기 위한 노력이 집중되고 있다. 기존의 1세대의 막심-길버트 혹은 생거 염기서열 분석법은 물론 최근에 생물정보학(bioinformatics)과 빅데이터 분석법의 발달과 더불어 짧은 시간 내에 수많은 유전체들을 한번에 분석하는 차세대 염기서열 분석법(NGS)이 활발히 개발되어 암 유전체 분석 및 진단에 적극 활용되고 있다. 2004년 첫 상용화가 이루어진 이후 NGS를 기반으로 한 염기서열 분석 방법은 지속적으로 다양화되고 진보되었다. 그러나 이는 여전히 개선되어야 할 많은 문제점들을 가지고 있다. 우선, 1세대 염기서열법에 비하여 아직까지는 정확성이 많이 떨어진다는 단점이 있다. NGS는 증폭해낸 모든 서열을 분석하기 때문에 증폭 과정에서 발생한 무작위한 염기서열의 돌연변이로 인한 오류에 몹시 취약하다. 이를 보완하기 위해서는 서열들을 반복적으로 분석하여 서로 겹쳐 읽어보면서 교정해야만 한다. 기존의 염기서열 방법보다는 비용을 많이 줄였지만, 유전체 당약 5000 달러 정도의 추가 비용이 발생한다. 유전자 바이오마커의 총량이 상대적으로 많지 않은 초기 암의 경우에 정밀한 진단을 위한 반복적 염기서열 분석 과정에서는 보다 큰 비용이 소요될 것으로 예상된다. 대안으로 3세대 염기서열 분석법(third-generation sequencing)이라 불리는 단일분자염기 서열분석법이 등장하기도 했다[9]. 미량의 시료를 PCR 증폭 없이 분석 가능하며, 비교적 판독 길이가 길다는 장점이 있지만, 아직까지는 개발 단계 수준에 머물러 있다. 특히 기존의 전체 유전체의 긴 염기길이 기반의 분석법이 고비용과 장시간의 분석기간 등으로 지양되고 있다. 한편, 암 질환 특이적 짧은 염기서열을 이용한 실시간의 차세대 염기서열 분석기법의 성공으로 급변하는 암 환경의 제어를 위한 약물 선별이 임상에서 점차 선호되고 있다. 특히, 대상 암질환에 대해서 특이성이 입증되고 있는 짧은 염기길이의 miRNA들이 큰 관심을 받고 있다. 본문에서는 암 대상 특이적인 상대적으로 짧은 염기길이의 유전체 바이오마커인 miRNA들을 중심으로, 기존의 서열분석에서 유전자 증폭단계 없이 (1) 검출 시스템을 활용한 기 선정된 대상 miRNA의 직접 검출과 (2) 신호 증폭을 통한 감도 향상의 간접 검출로 나누어서, 효과적인 액체 샘플 내 miRNA의 모니터링에대한 대표적인 공학적 연구방법들 만을 기술하고자 한다.

 

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그림 1. 대상 miRNA들을 검출하기 위한 방법은 그 원리에 따라 FRET, 전기화학법, 비색법등이 선호되어 사용된다.


2. 검출 시스템을 이용한 기 선정된 대상 miRNA들의 검출


잘 알려진 암이나 종양에 특이적인 염기서열들을 지정하고, 상보적인 서열을 이용해 검출 시스템을 구현하는 방법이 집중 연구되고 있다(그림 1). 검출의 대상이 되는 핵산 바이오마커로서 최근 마이크로-RNA(microRNA; miRNA)가 주목을 받고 있다.
miRNA는 19~25 뉴클레오타이드(핵염) 길이의 짧은 RNA 가닥으로 세포내 메신저 RNA (mRNA)의 3-말단의 비해 석부위(untranslated region, UTR)와 특이적인 상보적 결합을 통해 단백질로 번역을 억제하거나 mRNA의 분해를 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 인간 세포 내에는 약 1000 종류의 miRNA들이 존재하고, 각 miRNA들은 약 100가지의 mRNA의 조절에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 miRNA의 발현 프로파일을 대상으로 암 환자에 대한 바이오마커로 적극 활용할 수 있는데, 이는 바로 특정 miRNA들이 종양 형성 및 암의 진행 과정에 대한 정보를 알려주는 아주 중요한 단서가 되기 때문이다[10,11]. 또한 비교적 짧은 염기 서열 길이로 인해 검출 시스템을 구성하는 데 유리하다는 장점도 가지고 있다. 따라서 환자의 액체 생검 샘플이나 단일 세포 수준에서 다중 miRNA의 검출에 대한 중요성이 급속히 증가하고 있다.


2.1 형광 공명 에너지 전이 (fluorescence resonance energy transfer, FRET)를 통한 검출 시스템

바이오마커 검출 시스템을 디자인하는 데 있어 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer,FRET) 현상을 이용하는 경우가 많다. 이는 두 형광물질이 서로 가까운 거리에 있을 때 공명 효과를 통해 에너지를 교환하는 것을 말한다[12]. 에너지를 전달해주는 쪽을 형광 공여체(donor), 받는 쪽은 형광 수여체(acceptor)라 한다. FRET 현상이 이루어지기 위해서는 공여체의 방출 파장과 수여체의 흡수 파장이 비슷한 영역을 가져야만 한다.
Zongwen Jin과 그 연구팀은 Cy3.5, Cy5, Cy5.5등을 형광 수여체로 Lumi4-Tb 을 형광 공여체로 활용하여 특정 miRNA를 검출하는데 성공하였다(그림 2(a)) [13]. 연구팀은 총 네 가지의 염기서열을 디자인했는데, 먼저 두 가지 서열은 FRET 서열로 Lumi4Tb와 Cy3.5, Cy5, Cy5.5의 형광 물질들이 부착되어 있다. 나머지 두 개의 염기서열은 어댑터 서열로써 이들 miRNA의 절반과 결합할 수 있다. 어댑터 서열의 나머지 부분은 FRET 서열과 상보적 결합을 할 수 있기 때문에 어댑터 서열의 종류에 따라 FRET 서열이 이중결합을 이루며 부착된다. 결과적으로 FRET 서열에 표지 된 두 개의 형광 물질이 서로 가까워지게 되고, 결국에 FRET 현상이 발생한다. 이 방법을 이용하여 연구팀은 혈청 샘플에서 세 종류의 miRNA들을 0.9 nM 농도의 낮은 감도까지 검출할 수 있음을 증명하였다.

 

2.2 전기화학적 방법 (electrochemical Method)

높은 민감도로 대상 miRNA를 검출하기 위해서 전기화학적 방법을 이용하기도 한다.
전기화학적 방법의 기본 원리는 바로 산화환원 반응이다[14]. 대상 miRNA와 검지부의 상호작용으로부터 산화환원 반응을 유도하고 이 반응 정도는 전극으로 측정할 수 있다. 전기화학적 검출 방식은 전기 화학적 상태를 감지하는 메커니즘에 따라 전류계 센서(electrochemical sensor), 전압계 센서(amperometric sensor) 및 전기 화학적 임피던스 스펙트럼 센서(electrochemical impedance spectroscopy sensor)로 분류된다[15,16]. 감지된 신호들을 통해 대상 물질 농도로 얻어내기 위해서는 표준 곡선을 그린 뒤, 실제 농도로 환산하는 작업을 거쳐주어야 한다. 일반적으로 전극은 반응용액으로부터 전기화학적 변화를 용이하게 감지할 수 있도록 금, 그래핀, 탄소 등 다양한 물질로 제작된다[17,18]. 또한 대상 물질의 효과적인 검출을 위해, 검지체의 염기서열을 전극에 부착하여 사용하는 것이 일반적이다.
Mostafa Azimzadeh의 연구팀에서는 전기화학적 나노 바이오 센서를 통해 혈장 샘플에 있는 miRNA를 탐지해냈다(그림 2(b)) [19]. 연구팀에서는 먼저 그래핀 산화물(graphene oxide)이 코팅된 유리 탄소 전극(glass-carbon electrode, GCE)에 금 나노 막대를 코팅하였다. 그리고 대상 miRNA와 상보적인 염기서열의 말단에 싸이올기(thiolgroup, -SH)를 첨가하여 금 나노 막대 표면에 상보적 염기서열을 고정시켰다. 이 검출 시스템을 대상 miRNA와 반응시킨 후 Oracet blue 용액을 처리하면, Oracet blue가 이중결합 서열에 삽입되고, 즉시 환원된다. 환원 정도는 전위차펄스를 단계적으로 높아지게 하면서 주기적으로 가한 뒤, 이에 해당하는 전류를 측정하여 얼마나 샘플이 환원 되었는지 측정하는 시차펄스전압(differential pulse voltammetry, DPV)에 의해 측정되었다. 이 검출 시스템은 0.6 fM의 낮은 검출 한계를 보였다.

 

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​그림 2. 대상 miRNA들을 검출하는 다양한 방법. (a) FRET을 이용한 검출 방법 예시. miRNA에 의해 대상 검출을 위한 서열 두 개가 이어지고, 이 위에 FRET 서열이 붙어 형광을 주고 받는다. 형광 수여체에 따라 여러 개의 miRNA를 다중 진단 가능하다. (b) 전기화학적 접근법 예시. GCE전극에 GO/AuNR-DNA 프로브를 코팅한다. 대상 miRNA는 핵산(DNA)프로브에 상보적 결합을 만들고, 이 이중결합 사이에 Oracet blue를 삽입(intercalation) 시킨다. 이 과정에서 환원되는 신호를 검출해낸다. (c) 비색법을 통한 miRNA 검출법 예시. 녹색형광단백질이 표지된 T7 파지(phage)를 군체로 키운 뒤, 이를 셈하여 대상 miRNA를 검출해낸다. T7파지를 군체로 만들기 위해, 먼저 T7 파지를 금 나노 입자와 결합시킨다. 그리고 금 나노 입자는 대상 miRNA를 매개로 산화 철과 연결된다. 그 후 자기적으로 T7 파지를 모은 후 이를 적정 조건에서 배양시켰다.


2.3 비색법 (colorimetric method)
앞서 말한 FRET과 전기화학적 방법은 원하는 물질을 검출해내기 위해서 검출 시스템 구축이 필요하다. 즉, FRET의 경우 형광을 측정하는 장비가, 전기화학법은 전극과 전압, 전류 등의 측정 장비가 필수적이다. 따라서 장비에 추가적인 비용이 발생하게 되고, 즉각적인 검출 유무를 확인하기 어렵다는 한계가 있다. 이 대안으로 맨눈으로 색의 변화를 관찰하는 비색법이 개발되었다. 기본적으로 비색법을 사용하기 위해서는 변화가 색으로 표현되는 반응을 찾아내는 것이 중요하다. 색깔의 변화를 맨눈으로 확인할 수 있는 대표적인 반응에는 나노 물질의 광학적 특성 변화와 특정 화학물질들의 산화가 있다[20,21]. 이 방법은 비록 FRET이나 전기화학적 방법에 비해서는 대상 물질의 민감도가 낮지만, 상업적으로 접근하기 쉽고, 기타 측정 장비가 필요하지 않은 높은 편의성으로 인해 꾸준히 연구되고 있다.
Xin Zhou의 연구팀에서는 파지의 군체를 이용한 비색법을 구현해냈다(그림 2(c)) [22]. 연구팀은 유전적으로 변화시킨 T7 파지에 녹색 형광 단백질을 표지 시키고, 금 나노 입자를 부착시켜 금 나노 입자-파지 복합체를 형성했다. 금 나노 입자와 산화 철 입자에는 대상 miRNA를 매개로 두 입자가 연결될 수 있도록 miRNA와 상보적인 서열들을 붙여주었다. 이후 대상 miRNA로 인해 연결된 금 나노 입자-파지 복합체와 산화 철 입자를 자성에 의해 선별적으로 걸러내고, 이를 파지가 잘 자라는 조건에서 배양하면 군체를 형성하며 자라게 된다. 결과적으로 파지의 군체 개수를 셈으로써 초기 miRNA의 양을 측정할 수 있다. 이 방법을 통해 세 시간 이내로 대상 물질을 3 aM까지 측정이 가능하였다.

 

3. 신호 증폭을 활용한 감도 향상


검출하고자 하는 대상 물질을 선정한 후 검출해 내는 방법을 개발함에 있어 시스템의 민감성과 특이성은 매우 큰 화두이다. 바이오마커를 이용하여 암이나 종양을 진단하기 위해서는 정상상태와 구분이 가능할 정도의 충분한 신호가 필요하기 때문이다. 특히, 바이오마커의 종류에 따라 그 양이 충분하지 못한 경우가 빈번한데, 이를 극복하기 위해서 기존의 검출 방식들(형광 증폭, 전기 신호 전달, 비색법 등)을 조합하는 여러 연구들이 진행되고 있다.

 

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그림 3. 신호 증폭과 miRNA 검출방법의 결합. (a) FRET 과 rolling circle amplification 의 결합 예시. 대상 miRNA는 자물쇠형 프로브에 결합되며, T4 핵산접합효소(T4 ligase)에 의해 자물쇠 틈이 봉합된다. 이후 DNA 중합효소로부터 프로브에 상보적인 서열이 증폭된다. 이렇게 증폭된 서열에 FRET 서열들이 붙어 형광을 증폭시킨다. (b) 전기화학법과 신호증폭의 결합 예시. 그림에서 대상 miRNA가 있을 때, 이와 상보적인 DNA1은 분해된다. 분해되지 않은 DNA1은 신호를 나타내는 DNA2와 결합되어 DNA2를 분해되도록 한다. 즉, miRNA의 존재는 DNA2의 분해를 막아주어 신호를 만들게 한다. (c) 비색법과 신호증폭의 결합 예시. 대상 miRNA와 fuel-DNA는 토홀드(toehold)를 매개로 한 염기서열교환 반응에 의하여 재사용된다. 처음에는 금 나노 입자가 자기적으로 응집되어 있어 용액은 무색을 띤다. 하지만 염기서열교환을 통해 산화 철입자로부터 떨어져 나오는 금 나노 입자에 의해 용액의 색이 붉게 변한다.

 

3.1 효소를 이용한 신호 증폭과 FRET 기술의 혼용(효소를 이용한 신호 증폭 + FRET)
효소를 이용하여 대상물질을 증폭하고 이를 FRET으로 검출해 낼 수 있다. Xuri Wu와 그 연구팀에서는 회전환증폭(rolling circle amplification) 방법을 활용하여 miRNA를 검출하는데 성공하였다(그림 3(a)) [23]. 연구팀은 효과적인 시그널의 증폭을 위해 자물쇠형 검지체(프로브)를 제작하였다. 자물쇠형 프로브는 대상 miRNA에 상보적인 서열과 FRET 형광이 표지 된 프로브 두 개에 상보적이게 디자인되었다. 먼저 대상 miRNA가 자물쇠 구조의 프로브를 반응시켜 이중결합을 형성하도록 한 후, T4 핵산 접합효소(T4 DNA ligase)를 이용하여 둥근 DNA 프로브를 최종 형성하였다. 둥근 핵산(DNA) 프로브에 핵산 중합효소가 결합하여 반복적인 핵산 체인을 형성하고, 길게 형성된 체인에 FRET 프로브가 결합되며, FRET 시그널이 증폭되는 것이다. 이 방법을 통해 Xuri Wu 연구팀은 103 aM의 샘플 농도까지 검출하는 것이 가능함을 증명하였다.


3.2 효소를 이용한 신호 증폭 + 전기화학적 방법
효소를 이용한 시그널 증폭방법은 전기화학 방식과도 결합이 가능하다. Xiansheng Zhang과 그의 연구팀은 효소 증폭을 이용하여 대상 miRNA의 검출민감도를 높였으며 이를 전기화학적 방식으로 측정해냈다(그림 3(b)) [24]. 연구진들의 시스템은 두 가지의 증폭 사이클과 템플릿으로 사용되는 DNA1, miRNA 서열과 이어지면서 DNA1의 일부와 상보적으로 결합하는 DNA2, 그리고 싸이올기가 있어 금 전극에 실질적으로 신호를 보내는 역할을 하는 DNA3를 통해 이를 구현하였다. 첫 번째 사이클에서 miRNA와 DNA2는 DNA1과 결합한 뒤, T4 RNA ligase 2에 의해 서로 연결 된다. T7 엑소뉴클레아제(T7 exonuclease)에 의해 DNA1은 분해된다. 두 번째 사이클에서는 DNA1과 DNA3가 결합하게되고, T7 엑소뉴클레아제에 의해 DNA3가 분해된다. 결국 대상으로 하는 miRNA가 많을 때는 DNA1이 분해되어 DNA3가 많이 남게 되고 큰 전기화학적 변화를 일으킨다. 이 방법으로 위암환자의 혈액 샘플에서 0.36 fM까지 대상물질을 검출할 수 있었다.


3.3 염기서열 교환 반응 + 비색법
토홀드(발판, toehold)를 이용한 염기 서열 교환 반응(toehold-mediated DNA strand displacement reaction)은 신호를 증폭하는데 요긴하게 쓰일 수 있는 반응이다. 이 반응은 주형이 되는 서열과 더 강하게 이중결합을 형성하려고 하는 힘에 의해서 원래 붙어있었던 염기서열을 떼어내고 더 강한 서열로 치환되는 교환 현상을 이용한 것이다.
Motoi Oishi 연구팀에서 이 토홀드 매개의 염기서열 교환 반응과 금 나노 입자를 통해 대상 miRNA가 검출되는 것을 색으로 표현하였다(그림 3(c)) [25]. 금 나노 입자는 잘 알려진 색깔 변화를 일으키는 나노 물질로써 용액에 분산되어 있을 경우에는 표면 플라즈만 공명(surface plasmon resonance)에 의해 붉은 색을 띤다. 하지만, 금 나노 입자를 둘러싼 표면 전하들의 안정성이 파괴되면, 응집되어 큰 입자가 되고, 파란색으로 변한다. 금 나노 입자를 용액으로부터 분리 또는 제거하는 경우에는 붉은색에서 투명한 색으로 변화를 보인다.

이러한 특징을 이용하기 위해 우선 연구팀은 금 나노 입자와 산화 철 입자를 만들고, 각각의 입자에 서로 다른 단일가닥 염기서열을 부착시켰다. 부착된 서열은 하나의 기판에 다른 방향으로 상보적 결합을 하면서 두 입자를 연결 시킨다. 산화 철 입자는 자성에 반응하므로 자석을 이용해 한 쪽으로 입자들을 모아두면 용액은 투명한 색을 띤다. 그 후 대상 miRNA와 연료 서열을 사용해 염기서열 교환 반응을 유도한다. 결과적으로 대상하는 miRNA가 있으면, 금 나노 입자에 부착된 염기서열이 기판에서 떨어져 나와 용액의 색이 붉어진다. 이 변화들은 눈으로 확인이 가능하며 5 pM의 검출 한계를 보였다. 또한 용해된 세포에 들어있는 대상 miRNA까지도 검출 가능한 것으로 보고되었다.

 

4. 결론


인간게놈프로젝트를 통해 인간의 유전자 지도를 완성한 이래로, 암 질환을 효과적으로 진단하기 위한 시도가 지속적으로 이어져왔다. 이에 대한 결과로써 다양한 유전체 바이오마커들이 개발되었으며, 특히 짧은 염기서열을 가진 질환 특이적인 miRNA들을 액체 샘플링 상에서 직접 실시간으로 검출할 수 있는 다양한 방식들 또한 함께 발전되어왔다. 하지만 단기간 끊임없는 연구 노력에도 불구하고 아직까지는 조직검사나 단층촬영 등의 기존 방식들이 임상에서 선호되고 있다. miRNA를 활용한 분자 진단은 일부에 지나지 않는다. NGS를 액체 생검과 결합하여 임상에 직접 적용하려는 노력과 NGS를 넘어서는 3세대 염기서열 분석법 개발들이 진행 중에 있을 뿐 아니라, 이와 경쟁적으로 보다 간편하고 빠르게 짧은 염기서열화나 증폭단계 등의 추가 과정 없이 대상 유전체 물질(여기서, miRNA들)의 형광, 전기화학 등의 첨단 공학 방식을 활용한 검지기술들이 활발히 개발되고 있다. 이와 같은 끊임없는 노력들을 통해서 액체 생검만으로 암 질병을 정밀 진단하고 개인의 특성에 따라 효과적으로 맞춤 치료하는 인류 미래가 곧 실현 될 것으로 확신한다.

 

참고문헌
1. Iyer, V. R. et al. MRI, CT, and PET/CT for ovarian cancer detection and adnexal lesion characterization. American Journal of Roentgenology, 194, 311-321 (2010).
2. Pastorino, U. et al. Early lung-cancer detection with spiral CT and positron emission tomography in heavy smokers: 2-year results. The Lancet, 362, 593-597 (2003).
3. Merlo, L. M. et al. The role of genetic diversity in cancer. The Journal of clinical investigation, 120, 401 (2010).
4. Robertson, E. G. et al. Tumour seeding following percutaneous needle biopsy: the real story! Clinical radiology, 66, 1007-1014 (2011).
5. Hompes, D. et al. Review: incidence and clinical significance of bevacizumab-related nonsurgical and surgical serious adverse events in metastatic colorectal cancer. European Journal of Surgical Oncology (EJSO) 37, 737-746 (2011).
6. Anker, P. et al. Detection of circulating tumour DNA in the blood (plasma/serum) of cancer patients. Cancer and Metastasis Reviews 18, 65-73 (1999).
7. Koffler, D. et al. The occurrence of single-stranded DNA in the serum of patients with systemic lupus erythematosus and other diseases. Journal of Clinical Investigation 52, 198-204 (1973).
8. Kreso, A. et al. Variable clonal repopulation dynamics influence chemotherapy response in colorectal cancer. Science 339, 543-548 (2013).
9. Schadt. E. E. et al. A window into third-generation sequencing. Human molecular genetics 19 (2010).
10. Feiersinger, F. et al. MiRNA-21 Expression Decreases from Primary Tumors to Liver Metastases in Colorectal Carcinoma. PloS one 11, e0148580 (2016).
11. Tavazoie, S.F. et al. Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis. nature 451, 147-152 (2008).
12. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer. Current opinion in biotechnology 6, 103-110 (1995).
13. Jin, Z., Geißler, D., Qiu, X., Wegner, K.D. & Hildebrandt, N. A Rapid, Amplification-Free, and Sensitive Diagnostic Assay for Single-Step Multiplexed Fluorescence Detection of MicroRNA. Angewandte Chemie International Edition 54, 10024-10029 (2015).
14. Drummond, T. G. et al. Electrochemical DNA sensors. Nature biotechnology 21, 1192 (2003).

15. Chang, B. Y. et al. Electrochemical impedance spectroscopy. Annual Review of Analytical Chemistry 3, 207-229 (2010).
16. Heinze, J. Cyclic voltammetry—“electrochemical spectroscopy”. Angewandte Chemie International Edition 23, 831-847 (1984).
17. Yang, Y. et al. Enhanced charge transfer by gold nanoparticle at DNA modified electrode and its application to label-free DNA detection. ACS applied materials & interfaces 6, 7579-7584 (2014).
18. Lv. W. et al. Graphene-DNA hybrids: self-assembly and electrochemical detection performance. Journal of Materials Chemistry 20, 6668-6673 (2010).
19. Azimzadeh, M., Rahaie, M., Nasirizadeh, N., Ashtari, K. & Naderi-Manesh, H. An electrochemical nanobiosensor for plasma miRNA-155, based on graphene oxide and gold nanorod, for early detection of breast cancer. Biosensors and Bioelectronics 77,99-106 (2016).
20. Lyle, M. The brown-green color transition in marine sediments: A marker of the Fe (III)-Fe (II) redox boundary. Limnology and Oceanography 28, 1026-1033 (1983).
21. Elghanian, R. Selective colorimetric detection of polynucleotides based on the distance-dependent optical properties of gold nanoparticles. Science 277, 1078-1081 (1997).
22. Zhou, X. et al. Phage-mediated counting by the naked eye of miRNA molecules at attomolar concentrations in a Petri dish. Nature materials 14, 1058-1064 (2015).
23. Zadran, S., Remacle, F. & Levine, R. Microfluidic chip with molecular beacons detects miRNAs in Human CSF to reliably characterize CNS-specific disorders. RNA & DISEASE 3 (2016).
24. Li, B. et al. Two-stage cyclic enzymatic amplification method for ultrasensitive electrochemical assay of microRNA-21 in the blood serum of gastric cancer patients. Biosensors and Bioelectronics 79, 307-312 (2016).
25. Oishi, M. & Sugiyama, S. An Efficient Particle-Based DNA Circuit System: Catalytic Disassembly of DNA/PEG-Modified Gold Nanoparticle–Magnetic Bead Composites for Colorimetric Detection of miRNA. Small 12, 5153-5158 (2016).